Molécula de ADN recombinante, codificante de una proteína de fusión quimérica,

en la que una FKBP o dominio de tipo FKBP humana es un andamiaje de plegamiento en el que se injerta un dominio solapa insertado de un chaperón peptidil-prolil-cis/trans-isomerasa de E. coli (PPIasa), comprendiendo:

a) una secuencia de nucleótidos codificante de un dominio solapa insertado de un chaperón PPIasa de E. coli del tipo FKBP

b) cadena arriba del mismo, una secuencia de nucleótidos codificante de la FKBP12 humana según SEC ID nº 3, partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 1 y nº 20 de SEC ID nº 3 y finalizando C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 70 y nº 89 de SEC ID nº 3, y

c) cadena abajo del mismo, una secuencia de nucleótidos codificante de la FKBP12 humana según SEC ID nº 3, partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 90 y nº 97 de SEC ID nº 3 y finalizando C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 103 y nº 107 de SEC ID nº 3.

Proteína de fusión quimérica con actividades de chaperón y de plegamiento superiores La presente invención se refiere a la clonación, expresión y usos de una proteína de fusión quimérica con actividades de chaperón y de plegamiento superiores comparado con las contrapartidas de origen natural.La presente invención se refiere a una proteína de fusión quimérica codificada por una molécula de ADN recombinante que comprende secuencias de nucleótidos codificantes de un segmento de unión a polipéptido de una proteína chaperona de E. coli y a secuencias de nucleótidos codificantes de una proteína de unión a FK506 humana (FKBP)

o a un dominio de tipo proteína de unión a FK506 (dominio de tipo FKBP que es FKBP12) , a métodos de producción de dichas proteínas de fusión quiméricas y a sus usos como adyuvantes de plegamiento en la producción de otras proteínas y para la inmunización de animales de laboratorio y en el procedimiento de producción de vacunas o de farmacéuticos, a su utilización como módulo de fusión en la tecnología de las proteínas recombinantes y como adyuvantes de plegamiento en la realización de inmunoensayos.

Antecedentes

En la actualidad, los chaperones moleculares desempeñan un importante papel en un amplio abanico de aplicaciones biotecnológicas (Mogk et al, . Chembiochem. 3:807-814, 2002) . Existe un gran número de adyuvantes de plegamiento, que presentan propiedades de chaperón, así como enzimáticas. Por estos motivos, resultan útiles para una diversidad de aplicaciones prácticas en el campo del plegamiento de proteínas.

Los chaperones, conocidos como "adyuvantes de plegamiento" clásicos, son polipéptidos que ayudan en el plegamiento y mantenimiento de la integridad estructural de otras proteínas. Presentan la capacidad de estimular el plegamiento de un polipéptido tanto in vivo como in vitro. Generalmente los adyuvantes de plegamiento se subdividen en catalizadores y chaperones de plegamiento. Los catalizadores de plegamiento aceleran las etapas limitantes de la velocidad de plegamiento de la proteína debido a su función catalítica. Posteriormente se describen en mayor detalle ejemplos de catalizadores. Es conocido que los chaperones se unen a superficies desnaturalizadas, parcialmente desnaturalizadas o hidrofóbicas de polipéptidos y de esta manera ayudan a renaturalizar las proteínas o mantenerlas en solución. De esta manera, al contrario que los catalizadores de plegamiento, los chaperones meramente ejercen una función de unión (Buchner J., Faseb J. 10:10-19, 1996) . Los chaperones son proteínas ubicuas inducidas por estrés implicadas en la maduración, plegamiento, traslocación y degradación de las proteínas (Gething M.J. y Sambrook J., Nature 355:33-45, 1992) . Aunque también se encuentran presentes bajo condiciones de crecimiento normales, resultan abundantemente inducidas bajo condiciones de estrés. Lo anterior apoya adicionalmente la idea de que su función fisiológica es la adaptación bajo condiciones de estrés.

Hasta hoy se conocen varias familias diferentes de chaperones. Todos estos chaperones se caracterizan por su capacidad de unirse a proteínas desplegadas o parcialmente desplegadas y presentan una función fisiológica asociada al plegamiento correcto de las proteínas o a la eliminación de las proteínas desnaturalizadas o agregadas.

Son ejemplos bien caracterizados de chaperones los miembros de las familias de proteínas denominadas de choque térmico, que se denominan según su peso molecular relativo; por ejemplo hsp100, hsp90, hsp70 y hsp60, así como las denominadas shsps (proteínas de choque térmico pequeñas) , tal como se describe en Buchner J., Faseb J. 10:10-19, 1996 y en Beissinger M. y Buchner J., Biol. Chem. 379:245-59, 1998.

Los catalizadores de plegamiento, al contrario que los chaperones, ayudan al plegamiento mediante la aceleración de etapas limitantes de la velocidad, reduciendo de esta manera la concentración de los intermediarios de plegamiento con tendencia a la agregación. Una clase de catalizadores, las proteína disulfuro isomerasas (alternativamente denominadas tiol-disulfuro-oxidorreductasas) , cataliza la formación o la reorganización de enlaces disulfuro en las proteínas secretorias. En bacterias Gram-negativas, el plegamiento oxidativo de las proteínas secretorias en el periplasma es ajustado por una cascada de proteína disulfuro isomerasas denominadas DsbA, DsbB, DsbC y DsbD (Bardwell J.C., Mol. Microbiol. 14:199-205, 1994, y Missiakas D. et al., Embo J. 14:3415-24, 1995) .

Otra clase importante de catalizadores de plegamiento denominada peptidil-prolil-cis/trans-isomerasas (PPIs) comprende diferentes miembros, tales como CypA, PpiD (Dartigalongue C. y Raina S., Embo J. 17:3968-80, 1998) , FkpA (Danese P.N. et al., Genes Dev. 9:387-98, 1995) , factor inductor (Crooke E. y Wickner W., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:5216-20, 1987, y Stoller G. et al., Embo J. 14:4939-48, 1995) y SlyD (Hottenrott S. et al., J. Biol. Chem. 272:15697-701, 1997) .

Debido a la similitud entre las secuencias y la topología de las proteínas, las prolil-isomerasas se clasifican en tres familias diferentes: las ciclofilinas, las proteínas de unión a FK506 (FKBPs) y las parvulinas. Las ciclofilinas se unen y resultan inhibidas por el inmunosupresor ciclosporina A. Las parvulinas son una familia de prolil-isomerasas que no resultan inhibidas por la ciclosporina A ni por FK506. Las FKBPs se unen y resultan inhibidas por FK506 y por la rapamicina (el acrónimo FKBP se refiere a "proteína de unión a FK506") ; FK506 es un macrólido que se utiliza como fármaco inmunosupresor) . La primera estructura de rayos X de una FKBP que se determinó a alta resolución fue la de la FKBP 12 humana. Es una lámina º de cinco cadenas antiparalelas que se enrolla dextrógiramente en torno a una hélice a corta. La estructura de lámina º de cinco cadenas incluye los residuos 2 a 8, 21 a 30, 35 a 38 con 46 a 49, 71 a 76 y 97 a 106 (van Duyne et al., Science 252:839-842, 1991) . La investigación posterior ha demostrado que las FKBPs, así como las ciclofilinas y las parvulinas, forman una familia altamente conservada de enzimas presente en una amplia diversidad de organismos procarióticos y eucarióticos (para una revisión ver John E. Kay, Biochem. J. 314:361-385, 1996) . Por ejemplo, hasta hoy las prolil-isomerasas han sido identificadas en E. coli (2 parvulinas, 3 ciclofilinas y 5 FKBPs) .

Habitualmente, las FKBPs se definen según el criterio de unión, es decir, reconocen y se unen a FK506 con alta afinidad en el intervalo nanomolar. Sin embargo, existen dominio de tipo FKBP que ya no son susceptibles a la inhibición de la prolil-isomerasa por parte de FK506. Estos dominios de tipo FKBP comparten una similitud de secuencia significativa con FKBP12, aunque algunos de los residuos aminoácidos que median en la unión de FK506 se encuentran mutados, y la afinidad se encuentra desplazada al intervalo micromolar. Por ejemplo, SlyD y el factor inductor (dos PPIasas citosólicas del citosol de E. coli) pueden contemplarse como proteínas de tipo FKBP. Ambas prolil-isomerasas incluyen dominios que comparten una homología de secuencias significativa con FKBP12, aunque su afinidad de unión a FK506 es bastante pobre y es del orden micromolar (Scholz et al., Biochemistr y 45:20-33, 2006) . Sin embargo, en términos de similitud de secuencias y topología de la proteína, tanto SlyD como el factor inductor indudablemente son miembros de la familia de FKBP (Wülfing et al., J. Biol. Chem. 269 (4) :2895-2901, 1994; Callebaut y Mornon, FEBS Lett. 374 (2) :211-215, 1995) .

Los dominios de FKBP y los dominios de tipo FKBP podrían formar parte de moléculas de mayor tamaño con topologías complejas. En las células de mamífero, FKBP12, FKBP12A y FKBP13 contienen únicamente el dominio básico de FKBP, mientras que FKBP25 y FKBP52 presentan uno o más dominios de FKBP como parte de una molécula de mayor tamaño (para una revisión ver John E. Kay, Biochem. J. 314:361-385, 1996) .

También se encuentran FKBPs construidos modularmente en las células procarióticas. Por ejemplo, el factor inductor anteriormente indicado consiste de tres dominios bien separados con funciones diferentes. El dominio N media en la unión a la subunidad 50S del ribosoma de E. coli (Hesterkamp et al., J. Biol. Chem. 272 (35) :21865-71, 29 de agosto de 1997) . El dominio M (intermedio) incluye el sitio activo de la prolil-isomerasa (Stoller et al., FEBS Lett. 384 (2) :117-22, 15 de abril de 1996) y el dominio C comprende el sitio de unión de polipéptido que media en la unión de sustratos polipeptídicos extendidos... [Seguir leyendo]

1. Molécula de ADN recombinante, codificante de una proteína de fusión quimérica, en la que una FKBP o dominio de tipo FKBP humana es un andamiaje de plegamiento en el que se injerta un dominio solapa insertado de un chaperón peptidil-prolil-cis/trans-isomerasa de E. coli (PPIasa) , comprendiendo:

a) una secuencia de nucleótidos codificante de un dominio solapa insertado de un chaperón PPIasa de E. coli del tipo FKBP

b) cadena arriba del mismo, una secuencia de nucleótidos codificante de la FKBP12 humana según SEC ID nº 3, partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 1 y nº 20 de SEC ID nº 3 y finalizando C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 70 y nº 89 de SEC ID nº 3, y c) cadena abajo del mismo, una secuencia de nucleótidos codificante de la FKBP12 humana según SEC ID nº 3, partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 90 y nº 97 de SEC ID nº 3 y finalizando C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 103 y nº 107 de SEC ID nº 3.

2. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además:

d) por lo menos una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido diana.

3. Vector de expresión que comprende operablemente ligada una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 1 ó 2.

4. Célula huésped que comprende un vector de expresión según la reivindicación 3.

5. Proteína de fusión quimérica producida recombinantemente, en la que una FKBP o dominio de tipo FKBP humano es un andamiaje de plegamiento en el que se injerta un dominio solapa insertado de un chaperón peptidilprolil-cis/trans-isomerasa de E. coli (PPIasa) , comprendiendo:

a) una secuencia polipeptídica que contiene un dominio solapa insertado de un chaperón PPIasa de E. coli del tipo FKBP, b) una secuencia polipeptídica de la FKBP12 humana según SEC ID nº 3 que se fusiona con el extremo N-terminal de la secuencia polipeptídica a) , partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 1 y nº 20 de SEC ID nº 3 y finalizando C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 70 y nº 89 de SEC ID nº 3, y c) una secuencia polipeptídica de la FKBP12 humana según SEC ID nº 3 que se fusiona con el extremo C-terminal de la secuencia polipeptídica a) , partiendo N-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 90 y nº 97 de SEC ID nº 3 y finalizando C-terminalmente con cualquier aminoácido situado entre los aminoácidos nº 103 y nº 107 de SEC ID nº 3.

6. Método para producir una proteína de fusión quimérica según la reivindicación 5, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

a) cultivo de células huésped según la reivindicación 4, b) expresión de dicha proteína de fusión quimérica, y c) purificación de dicha proteína de fusión quimérica.

7. Proteína de fusión quimérica producida recombinantemente, producida mediante un método según la reivindicación 6.

8. Proteína de fusión producida recombinantemente según la reivindicación 5, caracterizada porque comprende además:

d) por lo menos un polipéptido diana.

9. Utilización de una proteína de fusión quimérica producida recombinantemente según las reivindicaciones 5, 7 ó 8 a modo de aditivo de un inmunoensayo o en una aplicación diagnóstica.

10. Utilización de una proteína de fusión quimérica producida recombinantemente según las reivindicaciones 5, 7 ó 8 a modo de adyuvante de plegamiento para proteínas diana in vitro.

11. Utilización de una proteína de fusión quimérica producida recombinantemente según las reivindicaciones 5, 7 ó 8 a modo de adyuvante de plegamiento en el procedimiento de producción de proteínas diana in vitro.

12. Utilización de una proteína de fusión quimérica producida recombinantemente según las reivindicaciones 5, 7 ó 8 a modo de pareja de fusión en el procedimiento de producción de proteínas diana in vitro.

13. Utilización de una proteína de fusión quimérica producida recombinantemente según las reivindicaciones 5, 7 ó 8 en un inmunoensayo.

14. Utilización de una proteína de fusión quimérica producida recombinantemente según las reivindicaciones 5, 7 ó 8 en el procedimiento de producción de farmacéuticos.

15. Composición que comprende una proteína de fusión quimérica producida recombinantemente según las reivindicaciones 5, 7 ó 8, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.