Una molécula de ácido nucleico que codifica

(i) una serina proteasa que tiene la capacidad de escindir fibrina y caseína,

que es

(a) una molécula de ácido nucleico que codifica la serina proteasa que comprende o está constituida por lasecuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4;

(b) una molécula de ácido nucleico que comprende o está constituida por la secuencia de nucleótidos deSEQ ID No. 3;

(c) una molécula de ácido nucleico que codifica una serina proteasa cuya secuencia de aminoácidos es almenos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de (a); preferiblemente al menos un 85% idéntica,más preferiblemente al menos un 90% idéntica, y siendo la forma más preferida al menos un 95% idéntica;

(d) una molécula de ácido nucleico que comprende o está constituida por una secuencia de nucleótidos quees al menos un 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de (b), preferiblemente al menos un 85%idéntica, más preferiblemente al menos un 90% idéntica, y siendo la forma más preferida al menos un 95%idéntica;

(e) una molécula de ácido nucleico que está degenerada con respecto a la molécula de ácido nucleico de(d); o

(f) una molécula de ácido nucleico correspondiente a la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de (a)a (d) en la que T es sustituida por U;

(ii) un fragmento de la serina proteasa de (i) con la misma actividad de la serina proteasa de (i);

(iii) un propéptido de la serina proteasa de (i) que es escindido a su forma activa inmediatamente antes odurante el tratamiento de una herida, en el que el propéptido es codificado por una molécula de ácido nucleicoseleccionada entre

(a) una molécula de ácido nucleico que codifica el propéptido de serina proteasa que comprende o estáconstituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 6;

(b) una molécula de ácido nucleico que comprende o está constituida por la secuencia de nucleótidos deSEQ ID No. 5;

(c) una molécula de ácido nucleico que codifica un propéptido de serina proteasa cuya secuencia deaminoácidos es al menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de (a); preferiblemente al menosun 85% idéntica, más preferiblemente al menos un 90% idéntica, y siendo la forma más preferida al menosun 95% idéntica;

(d) una molécula de ácido nucleico que comprende o está constituida por una secuencia de nucleótidos quees al menos un 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de (b), preferiblemente al menos un 85%idéntica, más preferiblemente al menos un 90% idéntica, y siendo la forma más preferida al menos un 95%idéntica;

(e) una molécula de ácido nucleico que está degenerada con respecto a la molécula de ácido nucleico de(d); o

(f) una molécula de ácido nucleico correspondiente a la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de (a)a (d) en la que T es sustituida por U; o

(iv) un pre-propéptido de la serina proteasa de (i), en el que el pre-propéptido es codificado por una molécula deácido nucleico seleccionada entre

(a) una molécula de ácido nucleico que codifica el pre-propéptido de serina proteasa que comprende o estáconstituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2;

(b) una molécula de ácido nucleico que comprende o está constituida por la secuencia de nucleótidos deSEQ ID No. 1;

(c) una molécula de ácido nucleico que codifica un pre-propéptido de serina proteasa cuya secuencia deaminoácidos es al menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de (a); preferiblemente al menosun 85% idéntica, más preferiblemente al menos un 90% idéntica, y siendo la forma más preferida al menosun 95% idéntica;

(d) una molécula de ácido nucleico que comprende o está constituida por una secuencia de nucleótidos quees al menos un 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de (b), preferiblemente al menos un 85%idéntica, más preferiblemente al menos un 90% idéntica, y siendo la forma más preferida al menos un 95%idéntica;

(e) una molécula de ácido nucleico que está degenerada con respecto a la molécula de ácido nucleico de(d); o

(f) una molécula de ácido nucleico correspondiente a la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de (a)a (d) en la que T es sustituida por U.

Proteasa para el acondicionamiento de heridas y el cuidado de la piel

La invención se refiere a composiciones farmacéuticas y cosméticas, así como a artículos médicos que comprenden una proteasa, denominada desbrilasa, de Lucilia sericata para su uso en el acondicionamiento de heridas y el cuidado de la piel. La desbrilasa se identificó usando el transcriptoma larvario, es decir preparaciones de ARNm y conversión en ADNc, y se preparó usando técnicas recombinantes y posterior expresión en células huésped adecuadas. La proteasa de la invención tiene actividad fibrinolítica, caseinolítica y activadora de PAR-2 (receptor activado por proteasa 2) . En una realización, se proporcionan composiciones que comprenden desbrilasa para la limpieza de células necróticas, tejido y manguitos de fibrina de heridas que cicatrizan lentamente o no cicatrizan, conocida como desbridamiento. En otra realización, se proponen usos cosméticos de la desbrilasa en el campo del cuidado y el alisado de la piel.

La invención se refiere además a una molécula de ácido nucleico que codifica una serina proteasa que tiene la capacidad de escindir fibrina y caseína, que es una molécula de ácido nucleico que codifica la serina proteasa que comprende o está constituida por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 4 así como a moléculas de ácido nucleico que codifican precursores o fragmentos de dicha serina proteasa. Además, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende o está constituida por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 3 y una molécula de ácido nucleico que codifica una serina proteasa cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 80%, más preferido al menos un 85% y la forma más preferida es al menos un 90% idéntica a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 3. Cualquiera de los ácidos nucleicos anteriores, en los que T se sustituye por U también están dentro del alcance de la invención.

La cicatrización de heridas tiene tres fases distintas: (1) inflamación; (2) migración y proliferación celular; y (3) remodelado. En la fase inflamatoria, las proteasas son liberadas por células del sistema inmunitario. Diversas linfoquinas son secretadas a partir de neutrófilos y macrófagos, que modulan la siguiente fase de la cicatrización de heridas. La segunda fase se denomina fase de proliferación e incluye migración de fibroblastos, proliferación y la síntesis de nuevas moléculas de la matriz extracelular. Estos eventos parecen producirse en un orden determinado en el que moléculas de la matriz extracelular incluyendo fibronectina, colágeno y proteoglucanos son secretadas en el lecho de granulación. La fase inflamatoria alcanza un máximo a los 3 días. La segunda fase de la cicatrización de heridas normalmente alcanza un máximo aproximadamente de una a dos semanas después de la lesión y viene seguida por una tercera fase mucho más larga de remodelación tisular que comienza en un plazo de semanas y puede durar varios meses. Durante la fase de remodelación, la matriz de tejido conectivo madura a medida que las

fibras de colágeno desorganizadas son sustituidas por moléculas de colágeno más gruesas y más alineadas. Esta remodelación tisular eventualmente contribuye a la resistencia a la tracción de la herida y, a menudo, está acompañada por la formación de una cicatriz.

Una lesión cutánea virtualmente siempre implica una lesión de los vasos sanguíneos. La cicatrización de heridas, por lo tanto, también comprende el proceso de coagulación, que es un proceso complejo mediante el cual la sangreforma coágulos. Ésta es una parte importante de la hemostasia, mediante la cual la pared de un vaso sanguíneo dañado es cubierta por un coágulo que contiene plaquetas y fibrina para detener la hemorragia y comenzar la reparación preferida del vaso dañado. Los trastornos de la coagulación pueden conducir a un mayor riesgo de hemorragia y/o trombosis. La coagulación se inicia casi instantáneamente después de que una lesión del vaso 45 sanguíneo haya dañado el endotelio. Las plaquetas forman inmediatamente un tapón hemostático en el sitio de la lesión (hemostasia primaria) . La hemostasia secundaria se produce simultáneamente, en la que factores de coagulación en el plasma sanguíneo responden en una compleja cascada para formar hebras de fibrina que refuerzan el tapón plaquetario. La cascada de coagulación de la hemostasia secundaria tiene dos rutas, la ruta de activación por contacto (conocida anteriormente como la ruta intrínseca) y la ruta del factor tisular (conocida anteriormente como la ruta extrínseca) que conducen ambas a la formación de fibrina. Se sabe ahora que la ruta principal para la iniciación de la coagulación de la sangre es la ruta del factor tisular. Las rutas son una serie de reacciones, en las que un zimógeno (precursor enzimático inactivo) de una serina proteasa y su co-factor glucoproteico se activan para convertirse en componentes activos que catalizan a continuación la siguiente reacción en la cascada, dando como resultado finalmente fibrina reticulada. Los factores de coagulación son generalmente

55 serina proteasas, excepto por FVIII y FV que con glucoproteínas y el Factor XIII que es una transglutaminasa. La cascada de coagulación se divide convencionalmente en tres rutas. El factor tisular y la ruta de activación por contacto activan ambas la “ruta común final” de factor X, trombina y fibrina.

La fibrina es una proteína implicada en la coagulación de la sangre. Es una proteína fibrilar que es polimerizada para formar un tapón o coágulo hemostático -junto con plaquetas -en el sitio de una herida. La fibrina se prepara a partir de su zimógeno fibrinógeno, una glucoproteína soluble en plasma que es sintetizada por el hígado. En la cascada de coagulación, el zimógeno protrombina es activado a la serina proteasa trombina, que es responsable de convertir el fibrinógeno en fibrina. La fibrina es reticulada a continuación por el factor XIII para formar un coágulo.

65 La plasmina escinde proteolíticamente la fibrina en productos de degradación de fibrina, lo que inhibe la excesiva formación de fibrina. La plasmina es generada por la escisión proteolítica de plasminógeno, una proteína del plasma sintetizada en el hígado. Esta escisión es catalizada por el activador de plasminógeno tisular (t-PA) que es sintetizado y secretado por el endotelio. El plasminógeno es atrapado durante la formación de coágulos y es activado lentamente cuando la herida ha dejado de sangrar y el coágulo se ha disuelto.

La desintegración del coágulo durante la cicatrización de heridas es una etapa importante para permitir la formación y la remodelación de la matriz, tal como se ha descrito anteriormente. Se piensa que una causa potencial para heridas de cicatrización lenta o crónicas es una falta de fibrinolisis. Los llamados “manguitos de fibrina”, constituidos por fibrina, laminina, fibronectina, tenascina, colágeno y leucocitos dificultan el intercambio de nutrientes, factores de crecimiento y gas, conduciendo a anoxia, formación de ulcus y prevención de angiogénesis. La disolución proteolítica de estos “manguitos de fibrina” apoya la neovascularización, invasión de leucocitos, migración de fibroblastos, formación de un nuevo epitelio e induce la proliferación y la migración celulares. Además, la cicatrización de heridas es retardada por la presencia de pus, restos tisulares, bacterias y exudados que pueden ser retirados por agentes de desbridamiento.

El desbridamiento se define como la retirada de tejido no vital de las heridas. En heridas crónicas, el desbridamiento significa la eliminación de necrosis así como la retirada de los apósitos de heridas, cuerpos extraños y otras sustancias no vitales. El suficiente desbridamiento representa un prerrequisito básico para un proceso de cicatrización de heridas no retardado. Además de tratar los factores causantes de la cicatrización retardada de heridas, el desbridamiento debe ser la primera etapa en una preparación del lecho de la herida adaptado a la fase, adecuado para heridas crónicas. Se han descrito diferentes métodos de desbridamiento en heridas crónicas tales como cirugía, terapia con gusanos, láser, ultrasonidos, hidroterapia, método de húmedo a seco, autolisis, enzimas proteolíticas, desbridamiento osmótico o químico.

Los agentes de desbridamiento digieren rápidamente el tejido necrótico sin dañar a las células vivas, acelerando de

este modo los procesos de cicatrización. La búsqueda... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica

(i) una serina proteasa que tiene la capacidad de escindir fibrina y caseína, que es

(a) una molécula de ácido nucleico que codifica la serina proteasa que comprende o está constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4;

(b) una molécula de ácido nucleico que comprende o está constituida por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 3;

(c) una molécula de ácido nucleico que codifica una serina proteasa cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de (a) ; preferiblemente al menos un 85% idéntica, más preferiblemente al menos un 90% idéntica, y siendo la forma más preferida al menos un 95% idéntica;

(d) una molécula de ácido nucleico que comprende o está constituida por una secuencia de nucleótidos que

es al menos un 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de (b) , preferiblemente al menos un 85% idéntica, más preferiblemente al menos un 90% idéntica, y siendo la forma más preferida al menos un 95% idéntica;

(e) una molécula de ácido nucleico que está degenerada con respecto a la molécula de ácido nucleico de (d) ; o

(f) una molécula de ácido nucleico correspondiente a la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de (a) a (d) en la que T es sustituida por U;

(ii) un fragmento de la serina proteasa de (i) con la misma actividad de la serina proteasa de (i) ;

(iii) un propéptido de la serina proteasa de (i) que es escindido a su forma activa inmediatamente antes o

durante el tratamiento de una herida, en el que el propéptido es codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada entre

(a) una molécula de ácido nucleico que codifica el propéptido de serina proteasa que comprende o está constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 6;

(b) una molécula de ácido nucleico que comprende o está constituida por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 5;

(c) una molécula de ácido nucleico que codifica un propéptido de serina proteasa cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de (a) ; preferiblemente al menos un 85% idéntica, más preferiblemente al menos un 90% idéntica, y siendo la forma más preferida al menos

un 95% idéntica;

(d) una molécula de ácido nucleico que comprende o está constituida por una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de (b) , preferiblemente al menos un 85% idéntica, más preferiblemente al menos un 90% idéntica, y siendo la forma más preferida al menos un 95% idéntica;

(e) una molécula de ácido nucleico que está degenerada con respecto a la molécula de ácido nucleico de (d) ; o

(f) una molécula de ácido nucleico correspondiente a la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de (a) a (d) en la que T es sustituida por U; o

45 (iv) un pre-propéptido de la serina proteasa de (i) , en el que el pre-propéptido es codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada entre

(a) una molécula de ácido nucleico que codifica el pre-propéptido de serina proteasa que comprende o está constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2;

(b) una molécula de ácido nucleico que comprende o está constituida por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1;

(c) una molécula de ácido nucleico que codifica un pre-propéptido de serina proteasa cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de (a) ; preferiblemente al menos un 85% idéntica, más preferiblemente al menos un 90% idéntica, y siendo la forma más preferida al menos

55 un 95% idéntica;

(d) una molécula de ácido nucleico que comprende o está constituida por una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de (b) , preferiblemente al menos un 85% idéntica, más preferiblemente al menos un 90% idéntica, y siendo la forma más preferida al menos un 95% idéntica;

(e) una molécula de ácido nucleico que está degenerada con respecto a la molécula de ácido nucleico de (d) ; o

(f) una molécula de ácido nucleico correspondiente a la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de (a) a (d) en la que T es sustituida por U.

65 2. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. Una célula huésped transformada, transducida o transfectada con el vector de la reivindicación 2.

4. Un método de producción de una serina proteasa, un fragmento, propéptido o pre-propéptido de la misma de

acuerdo con la reivindicación 1, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 3 y aislar la serina 5 proteasa, el fragmento, el propéptido o el pre-propéptido producido.

5. Un/a

(i) serina proteasa o fragmento de la misma que tiene la capacidad de escindir fibrina y caseína; o

(ii) propéptido o pre-propéptido que es escindido a su forma activa inmediatamente antes o durante el tratamiento de una herida

codificado/a por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

6. Una proteína de fusión que comprende la serina proteasa, el fragmento, el propéptido, o el pre-propéptido de la reivindicación 5.

7. Una composición que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1, el vector de la reivindicación 2, la célula

huésped de la reivindicación 3, la serina proteasa, el fragmento, el propéptido o el pre-propéptido de la reivindicación 20 5, o la proteína de fusión de la reivindicación 6, o combinaciones de las mismas.

8. La composición de la reivindicación 7, que es una composición cosmética.

9. La composición de la reivindicación 7, que es una composición farmacéutica. 25

10. El ácido nucleico de la reivindicación 1, el vector de la reivindicación 2, la célula huésped de la reivindicación 3, la serina proteasa, el fragmento, el propéptido o el pre-propéptido de la reivindicación 5, o la proteína de fusión de la reivindicación 6 para la preparación de una composición cosmética para exfoliación de la piel, alisado de la piel o la intervención con la formación de cicatrices.

11. El ácido nucleico de la reivindicación 1, el vector de la reivindicación 2, la célula huésped de la reivindicación 3, la serina proteasa, el fragmento, el propéptido o el pre-propéptido de la reivindicación 5, o la proteína de fusión de la reivindicación 6 para su uso en el tratamiento de heridas.

12. El ácido nucleico, el vector, la célula huésped, serina proteasa, fragmento, propéptido, pre-propéptido o proteína de fusión de la reivindicación 11, en el que las heridas son heridas crónicas o de cicatrización lenta.

13. El ácido nucleico de la reivindicación 1, el vector de la reivindicación 2, la célula huésped de la reivindicación 3,

la serina proteasa, el fragmento, el propéptido o el pre-propéptido de la reivindicación 5, o la proteína de fusión de la 40 reivindicación 6 para el tratamiento de enfermedades cutáneas acompañadas por cicatrización alterada de heridas.

14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que comprende adicionalmente al menos un componente seleccionado entre el grupo de una proteasa adicional, nucleasa, excipiente, agente anti-microbiano y agente que alivia el dolor.

15. Un anticuerpo o fragmento o derivado del mismo que se une específicamente a la serina proteasa, el fragmento, el propéptido o el pre-propéptido de la reivindicación 5.

Figura 5A

Alineamiento de la secuencia de proteínas

>gi|1717788|sp|P51588.1|TRYP_SARBU RecName: Completa =Tripsina; Indicadores: Precursora gi|1177316|emb|CAA64354.1| enzima similar a tripsina [Sarcophaga bullata] Longitud =254

Valor = 427 bits (1099) , Esperado .

3. 118, Método: ajuste de matriz composicional Identidades = 195/254 (76%) , Positivas = 227/254 (89%) , Huecos = 0/254 (0%)

Figura 5B

Alineamiento de la secuencia de ADNc

>gi|1177315|emb|X94691.l|NBTRYPSIN ARNm de N. bullata para proteína similar a tripsina Longitud = 836

Valor = 571 bits (632) , Esperado .

2. 159 Identidades = 588/768 (76%) , Huecos = 6/768 (0%) Cadena = Más/Más

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

Literatura no patente citada en la descripción