Producción de un polipéptido en un líquido de cultivo sin suero con hidrolizado de proteínas vegetales.

Método para producción a gran escala de un polipéptido en células eucariotas contenidas en un líquido de cultivo sin suero,

dicho método comprendiendo

(i) una fase de propagación para dichas células, donde las células se propagan en un primer líquido de cultivo celular, y

(ii) una fase de producción para dichas células, donde las células están presentes en un segundo líquido de medio de cultivo celular, donde cada uno de los líquidos de cultivo celular comprenden un hidrolizado de proteínas vegetales, y

donde la proporción entre la concentración del hidrolizado de proteínas vegetales (C1) en el primer líquido de cultivo celular y la concentración del hidrolizado de proteínas vegetales (C2) en el segundo líquido de cultivo celular es al menos 1.5:1 (C1:C2) .

Producción de un polipéptido en un líquido de cultivo sin suero con hidrolizado de proteínas vegetales Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a métodos mejorados para producir polipéptidos interesantes en células eucariotas en un líquido de cultivo sin suero.

Antecedentes de la invención [0002] Métodos para producción a gran escala de polipéptidos, como polipéptidos del factor VII, en células eucariotas se conocen en la técnica, ver, por ejemplo, WO 02/29083, WO 02/29084 y WO 03/29442.

En la producción a gran escala de polipéptidos, como polipéptidos del factor VII, es deseable por cuestiones económicas prolongar la fase de producción para beneficiar completamente los esfuerzos puestos en la propagación del cultivo celular. También, se prevé que un índice de producción más constante para el polipéptido sobre un periodo temporal más largo hará el lote de polipéptido más homogéneo en que procesos postraduccionales (p. ej. glicosilación y formación de ácidos y-carboxílicos) se cree que proceden con más precisión para un cultivo celular "no estresado".

La WO 01/23527 divulga un medio de cultivo celular para el cultivo sin suero y sin proteínas de células. El medio contiene una proporción de un hidrolizado de soja (peptona de soja) .

Breve descripción de la invención [0005] La invención se refiere a modificación de la concentración de un componente de hidrolizado de proteínas vegetales en el líquido de cultivo celular durante un cultivo, para, al mismo tiempo, 1) conseguir crecimiento celular óptimo durante las fases de propagación, y 2) conseguir estabilidad óptima a largo plazo del cultivo con respecto a rendimiento en la fase de producción, y así aumentar el rendimiento total del polipéptido en cuestión, por ejemplo, un polipéptido del factor VII.

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método para producción a gran escala de un polipéptido en células eucariotas contenido en un líquido de cultivo sin suero, dicho método comprendiendo

(i) una fase de propagación para dichas células, donde las células se propagan en un primer líquido de cultivo celular, y

(ii) una fase de producción para dichas células, donde las células están presentes en un segundo líquido de

cultivo celular, donde cada uno de los líquidos de cultivo celular comprenden un hidrolizado de proteínas vegetales, y donde la proporción entre la concentración del hidrolizado de proteínas vegetales (C1) en el primer líquido de cultivo celular y la concentración del hidrolizado de proteínas vegetales (C2) en el segundo líquido de cultivo celular es al menos 1.5:1 (C1:C2) .

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un método para producción a gran escala de un polipéptido del factor VII en células eucariotas contenidas en un líquido de cultivo sin suero, dicho método comprendiendo

(i) una fase de propagación para dichas células, donde las células se propagan en un primer líquido de cultivo celular, y

(ii) una fase de producción para dichas células, donde las células están presentes en un segundo líquido de

cultivo celular, donde cada uno de los líquidos de cultivo celular comprenden un hidrolizado de proteínas vegetales, tal como hidrolizado de proteínas de soja, y donde la concentración del hidrolizado de proteínas vegetales (C2) en el segundo líquido de cultivo celular está en el intervalo de 0, 7-2, 2 g/L.

Breve descripción de los dibujos [0008]

La figura 1 ilustra un esquema de tratamiento de un proceso de cultivo. La figura 2 muestra un gráfico con los resultados de cultivo microportador en un fermentador de 20 L, cf. Ejemplo 1. La figura 3 muestra un gráfico con los resultados de cultivo microportador en un fermentador de 500 L, cf. Ejemplo 2.

Descripción detallada de la invención [0009] Como se ha mencionado anteriormente, un aspecto principal de la presente invención se refiere a un método para producción a gran escala de un polipéptido en células eucariotas contenido en un líquido de cultivo sin suero, dicho método comprendiendo

(i) una fase de propagación para dichas células, donde las células se propagan en un primer líquido de cultivo celular, y

(ii) una fase de producción para dichas células, donde las células están presentes en un segundo líquido de

cultivo celular, donde cada uno de los líquidos de cultivo celular comprenden un hidrolizado de proteínas vegetales, y donde la proporción entre la concentración del hidrolizado de proteínas vegetales (C1) en el primer líquido de cultivo celular y la concentración del hidrolizado de proteínas vegetales (C2) en el segundo líquido de cultivo celular es al menos 1.5:1 (C1:C2) .

Mediante el término "producción a gran escala" se entiende producción implicando un vaso de cultivo de al menos 100 L. En formas de realización preferidas, no obstante, la escala es típicamente al menos 250 L, tal como al menos 500 L, por ejemplo, al menos 1000 L o incluso 5000 L o más. El término "gran escala" se puede utilizar de forma intercambiable con los términos "escala de producción" y "escala industrial".

El método para producción a gran escala del polipéptido se conduce típicamente sobre un periodo de al menos 120 horas, por ejemplo, 1-26 semanas.

La presente invención debe entenderse como una mejora de métodos hasta ahora conocidos para producción a gran escala de un polipéptido en células eucariotas contenidas en un líquido de cultivo sin suero. Se conoce el uso de hidrolizados de proteínas vegetales en tales métodos, pero la presente invención proporciona pautas para mejorar los resultados de tales métodos.

Una característica del método del aspecto principal de la invención es controlar el contenido del hidrolizado de proteínas vegetales en los líquidos de cultivo celular, de manera que la fase de propagación al igual que la fase de producción se optimizan. Esto se hace asegurando que la proporción entre la concentración del hidrolizado de proteínas vegetales (C1) en el primer líquido de cultivo celular (usado para la fase de propagación) y la concentración del hidrolizado de proteínas vegetales (C2) en el segundo líquido de cultivo celular (usado para la fase de producción) es al menos 1.5:1 (C1:C2) .

Típicamente, la concentración de hidrolizados de proteínas vegetales en los líquidos de cultivo celular están en el intervalo 0, 01-10, 0 g/L. En algunas formas de realización, una concentración (C1) de alrededor de 5, 0 g/L se puede utilizar durante las fases de propagación, y la concentración se disminuye luego, de modo que la concentración del hidrolizado de proteínas vegetales (C2) en el segundo líquido de cultivo celular es, por ejemplo, 1, 0 g/L en el inicio de la fase de producción. Posteriormente, durante la fase de producción la concentración se puede tener a un nivel sustancialmente fijo o puede aumentarse alternativamente y disminuirse entre un valor bajo y uno alto, por ejemplo, entre 1, 0 g/L y 2, 0 g/L, para mantener un cultivo estable.

Dicho esto, la proporción C1:C2 está preferiblemente en el intervalo de 2:1 a 10:1, tal como 2.5:1 a 8:1 o en el intervalo de 3:1 a 6:1.

Además, la concentración C2 está típicamente en el intervalo de 0, 2-3, 5 g/L, tal como en el intervalo de 0, 7-3, 0 g/L, por ejemplo, en el intervalo de 0, 9-2, 5 g/L, tal como en el intervalo de 0, 9-2, 2 g/L, y la concentración C1 está típicamente en el intervalo de 4, 0-10, 0 g/L, tal como en el intervalo de 4, 5-8, 0 g/L.

Como se ha mencionado anteriormente, algunas veces es ventajoso para modificar ligeramente la concentración del hidrolizado de proteínas vegetales en el curso de la fase de producción, por ejemplo, variando la concentración dentro de una de los intervalos mencionados anteriormente, por ejemplo, en el intervalo de 0, 2-3, 5 g/L, tal como en el intervalo de 0, 7-3, 0 g/L, por ejemplo, en el intervalo de 0, 9-2, 5 g/L, tal como en el intervalo de 0, 9-2, 2 g/L.

Alternativamente, la concentración se mantiene a un nivel sustancialmente fijo.

El hidrolizado de proteínas vegetales se puede obtener de una de varias fuentes, por ejemplo, fuentes comerciales. Tipos típicos de hidrolizados son hidrolizado de proteínas de soja, hidrolizados de proteínas de trigo, hidrolizado de proteínas de guisante, hidrolizado de proteínas de arroz, etc. La WO 01/23527 A1, que es por la presente incorporada por... [Seguir leyendo]

1. Método para producción a gran escala de un polipéptido en células eucariotas contenidas en un líquido de cultivo sin suero, dicho método comprendiendo

(i) una fase de propagación para dichas células, donde las células se propagan en un primer líquido de cultivo celular, y

(ii) una fase de producción para dichas células, donde las células están presentes en un segundo líquido de

medio de cultivo celular, donde cada uno de los líquidos de cultivo celular comprenden un hidrolizado de proteínas vegetales, y donde la proporción entre la concentración del hidrolizado de proteínas vegetales (C1) en el primer líquido de cultivo celular y la concentración del hidrolizado de proteínas vegetales (C2) en el segundo líquido de cultivo celular es al menos 1.5:1 (C1:C2) .

2. Método según la reivindicación 1, donde la proporción C1:C2 está en el intervalo de 2:1 a 10:1.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la concentración C2 está en el intervalo de 0, 23, 5 g/L.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la concentración C1 está en el intervalo de 4, 010, 0 g/L.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el hidrolizado de proteínas vegetales es hidrolizado de proteínas de soja.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el polipéptido es un polipéptido del factor VII.

7. Método para producción a gran escala de un polipéptido del factor VII en células eucariotas contenidas en un líquido de cultivo sin suero, dicho método comprendiendo

(i) una fase de propagación para dichas células, donde las células se propagan en un primer líquido de cultivo celular, y

(ii) una fase de producción para dichas células, donde las células están presentes en un segundo líquido de medio de cultivo celular, donde el primer líquido de cultivo celular comprende un hidrolizado de proteínas de soja en una concentración de 4, 0-10, 0 g/L, el segundo líquido de cultivo celular comprende un hidrolizado de proteínas de soja en una concentración de 0, 2-3, 5 g/L, y donde la proporción entre la concentración del hidrolizado de proteínas de soja (C1) en el primer líquido de cultivo celular y la concentración del hidrolizado de proteínas de soja (C2) en el segundo líquido de cultivo celular es al menos 1.5:1 (C1:C2) .

8. Método para producción a gran escala de un polipéptido del factor VII en células eucariotas contenidas en un líquido de cultivo sin suero, dicho método comprendiendo

(i) una fase de propagación para dichas células, donde las células se propagan en un primer líquido de cultivo celular, y

(ii) una fase de producción para dichas células, donde las células están presentes en un segundo líquido de

cultivo celular, donde cada uno de los líquidos de cultivo celular comprenden un hidrolizado de proteínas vegetales, tal como hidrolizado de proteínas de soja, y donde la concentración del hidrolizado de proteínas vegetales (C2) en el segundo líquido de cultivo celular está en el intervalo de 0, 7-2, 2 g/L.

9. Método según la reivindicación 8, donde la concentración C2 está en el intervalo de 0, 9-2, 2 g/L.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, donde cada uno de los líquidos de cultivo celular comprenden un hidrolizado de proteínas vegetales, y donde la proporción entre la concentración del hidrolizado de proteínas vegetales (C1) en el primer líquido de cultivo celular y la concentración del hidrolizado de proteínas vegetales (C2) en el segundo líquido de cultivo celular es al menos 1.5:1.

11. Método según la reivindicación 10, donde la concentración C1 está en el intervalo de 4, 0-10, 0 g/L.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, 7 y 8-11, donde la concentración del hidrolizado de proteínas

vegetales tiene el siguiente perfil: concentración alta en la fase de propagación (C1) ; concentración baja en la fase de producción -nivel A bajo (C2A) ; concentración baja en la fase de producción -nivel B bajo (C2B) ; concentración baja en la fase de producción -nivel A bajo (C2A) ; concentración baja en la fase de producción -nivel B bajo (C2B) ;

etc. donde C1>>C2B >C2A y las concentraciones C2A y C2B están dentro de los intervalos de concentración especificados para C2, y donde el primer cambio de nivel A bajo (C2A) a nivel B bajo (C2B) se realiza cuando se observa una reducción en el número celular y el cambio posterior de nivel B bajo (C2B) a nivel A bajo (C2A) se realiza cuando el número celular se ha restaurado a un nivel aproximadamente correspondiente al nivel antes de la reducción.