PROCEDIMIENTO DE PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CELULOLÍTICAS Y HEMICELULOLÍTICAS UTILIZANDO LOS RESIDUOS DE DESTILACIÓN DE FERMENTACIÓN ETANÓLICA DE HIDROLIZADOS ENZIMÁTICOS DE MATERIALES (LIGNO)CELULÓSICOS.

Procedimiento de producción de etanol a partir de materiales celulósicos o lignocelulósicos que comprende las etapas siguientes:

1) el pretratamiento químico y/o físico de un substrato celulósico o lignocelulósico;

2) la hidrólisis enzimática del substrato pretratado utilizando enzimas celulolíticas producidas por los hongos pertenecientes a la especie Trichoderma reesei;

3) la fermentación etanólica por un microorganismo alcoholígeno apropiado del hidrolizado procedente de la etapa (2) y la obtención de un mosto de fermentación; y

4) la separación del microorganismo alcoholígeno utilizado en la etapa (3), la separación/purificación del etanol y la obtención de una fase acuosa que constituye un residuo, donde se utiliza el residuo constituido por los vinotes de destilación, tras la separación del etanol, como fuente de carbono inductora o total para la producción de dichas enzimas celulolíticas .

Procedimiento de producción de enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas utilizando los residuos de destilación de fermentación etanólica de hidrolizados enzimáticos de materiales (ligno) celulósicos La presente invención se relaciona con la producción de enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas, en el marco de la producción de etanol a partir de materiales celulósicos o lignocelulósicos, donde se utiliza el residuo constituido por los vinotes de destilación, tras separación del etanol, como fuente de carbono inductora o total para la producción de las enzimas celulolíticas.

Desde los años 1970, la transformación de la biomasa lignocelulósica en etanol, tras hidrólisis de los polisacáridos constitutivos en azúcares fermentables, ha sido objeto de numerosos trabajos.

Las maderas de árboles hojosos y las pajas de cereales son los substratos más utilizados. Están constituidas en su mayor parte por aproximadamente un 40 a un 50% de celulosa, un 20 a un 25% de hemicelulosa y un 15 a un 25% de lignina.

Son utilizables otros recursos, cultivos forestales dedicados, residuos de plantas alcoholígenos, azucareros y de cereales, residuos de la industria papelera y productos de transformación de los materiales celulósicos y lignocelulósicos.

De estos tres polímeros, celulosa, hemicelulosa y lignina, la celulosa es la principal fuente de azúcares fermentables en etanol, ya que está constituida por glucosa, siendo esta última fácilmente fermentada en etanol por Saccharomyces cerevisiae en procedimientos industriales probados y competentes. Las pentosas contenidas en las hemicelulosas no se convierten eficazmente en etanol. Se pueden seleccionar otros microorganismos entre los géneros Saccharomyces, Pichia, Candida, Pachysolen, Zymomonas, Klebsiella y Escherichia para valorizar los azúcares monoméricos procedentes de la biomasa en etanol.

El procedimiento de transformación de los materiales lignocelulósicos en etanol (véase la Figura 1) comprende una etapa de pretratamiento fisicoquímico, seguida de una etapa de hidrólisis enzimática o química, de una etapa de fermentación etanólica de los azúcares liberados y de una etapa de recuperación del etanol.

La etapa de pretratamiento tiene por objeto liberar los azúcares contenidos en las hemicelulosas en forma de monómeros, esencialmente pentosas, como la xilosa y la arabinosa, y hexosas, como la galactosa, la manosa y la glucosa, y mejorar la accesibilidad de la celulosa enganchada en la matriz de lignina y hemicelulosas. Existen numerosas tecnologías: cocciones ácidas, cocciones alcalinas, explosión al vapor, procedimientos organosolv, etc. Se mide la eficacia del pretratamiento por la tasa de recuperación de las hemicelulosas y por la susceptibilidad a la hidrólisis del residuo celulósico. Los pretratamientos ácido en condiciones suaves y por explosión al vapor son los mejor adaptados. Permiten una recuperación total de las pentosas y una buena accesibilidad de la celulosa a la hidrólisis.

El residuo celulósico es hidrolizado ya sea por vía ácida, ya sea por vía enzimática con la utilización de enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas. Microorganismos como los hongos pertenecientes a los géneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium o Schizophyllum, o las bacterias anaerobias pertenecientes, por ejemplo, al género Clostridium, producen estas enzimas, que contienen especialmente las celulasas y las xilanasas, adaptadas para la hidrólisis total de los polímeros que constituyen los vegetales.

La vía ácida, efectuada con ayuda de un ácido fuerte, el ácido sulfúrico especialmente, es eficaz pero requiere de importantes cantidades de productos químicos (ácido y luego base para la neutralización) . La hidrólisis enzimática no presenta este inconveniente; se efectúa, por otra parte, en condiciones suaves y es eficaz. Por el contrario, el coste de las enzimas sigue siendo muy elevado. Por ello, se han realizado muchos trabajos para reducir este coste: el aumento de la producción de enzimas en primer lugar, seleccionando las cepas hiperproductoras y mejorando los procedimientos de fermentación, y la disminución de la cantidad de enzimas en la hidrólisis a continuación, optimizando la fase de pretratamiento o mejorando la actividad específica de estas enzimas. En el curso de la última década, los principales trabajos están ligados a la comprensión de los mecanismos de acción de las celulasas y de expresión de las enzimas con el fin de hacer excretar el complejo enzimático más apropiado para la hidrólisis de los substratos lignocelulósicos modificando las cepas con las herramientas de biología molecular.

El microorganismo más utilizado para la producción de celulasas es el hongo Trichoderma reesei. Las cepas salvajes tienen la facultad de excretar, en presencia de un substrato inductor, la celulosa por ejemplo, el complejo enzimático considerado como el mejor adaptado para la hidrólisis de la celulosa. Las enzimas del complejo enzimático contienen tres grandes tipos de actividades: las endoglucanasas, las exoglucanasas y las celobiasas. Otras proteínas que poseen propiedades indispensables para la hidrólisis de los materiales lignocelulósicos son igualmente producidas por Trichoderma reesei, las xilanasas por ejemplo. La presencia de un substrato inductor es indispensable para la expresión de las enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas. La naturaleza del substrato carbonado tiene una fuerte influencia sobre la composición del complejo enzimático. Es el caso de la xilosa, que, asociada a un substrato carbonado inductor como la celulosa o la lactosa, permite mejorar significativamente la actividad llamada xilanasa.

Las técnicas de genética clásica por mutación han permitido la selección de cepas de Trichoderma reesei hiperproductoras de celulasas, tales como las cepas MCG77 (Gallo – patente EE.UU. 4.275.167) , MCG 80 (Allen, A.L. y Andreotti, R.E., Biotechnol-Bioengi 1982, 12, 451-459 1982) , RUT C30 (Montenecourt, B.S. y Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782) y CL847 (Durand et al., 1984, Proc. Colloque SFM, "Génétique des microorganismes industriels", Paris, H. HESLOT Ed., pp. 39-50) . Los mejoramientos han permitido obtener cepas hiperproductoras, menos sensibles a la represión catabólica sobre azúcares monoméricos especialmente, glucosa por ejemplo, con respecto a las cepas salvajes.

Se han obtenido cepas recombinantes a partir de las cepas de Trichoderma reesei Qm9414, RutC30 y CL847 clonando genes heterólogos, por ejemplo la invertasa de Aspergillus niger, para diversificar la fuente de carbono necesaria para la producción de celulasas, y/o sobreexpresando la celobiasa con el fin de mejorar el rendimiento de la hidrólisis enzimática, considerándose las celobiasas como las enzimas limitantes en la reacción. Estas cepas han conservado su hiperproductividad y su aptitud para ser cultivadas en fermentador.

El procedimiento de producción de celulasas por Trichoderma reesei ha sido objeto de mejoramientos importantes con vistas a la extrapolación a escala industrial.

Para obtener buenas productividades en enzimas, es necesario aportar una fuente de carbono rápidamente asimilable para el crecimiento de Trichoderma reesei y un substrato inductor que permita la expresión de las celulasas y la secreción en el medio de cultivo. La celulosa puede desempeñar estos dos papeles; sin embargo, es difícil de utilizar a nivel industrial y se la ha substituido por fuentes de carbono solubles, glucosa, xilosa o lactosa, teniendo igualmente la lactosa el papel de substrato inductor. Se han descrito otros azúcares solubles, como la celobiosa y la soforosa, como inductores, pero son demasiado costosos para ser utilizados a nivel industrial. Se ha constatado, sin embargo, que las producciones de celulasas por Trichoderma reesei, con substratos solubles, son muy inferiores a las obtenidas sobre celulosa en “batch”. Esto es debido al efecto represor de los azúcares fácilmente asimilables, a gran concentración. La alimentación de forma continua de los substratos carbonados solubles ha permitido levantar la represión catabólica limitando la concentración residual en los cultivos y optimizando la cantidad de azúcar que permite obtener un mejor rendimiento y una mejor productividad enzimática (véase la patente FR-B-2.555.603) .

La lactosa constituye, en un procedimiento de producción industrial de enzimas celulolíticas, uno de los substratos más apropiados y uno de los más baratos; sigue siendo, no obstante, costoso y representa aproximadamente... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de producción de etanol a partir de materiales celulósicos o lignocelulósicos que comprende las etapas siguientes:

1) el pretratamiento químico y/o físico de un substrato celulósico o lignocelulósico; 2) la hidrólisis enzimática del substrato pretratado utilizando enzimas celulolíticas producidas por los hongos pertenecientes a la especie Trichoderma reesei; 3) la fermentación etanólica por un microorganismo alcoholígeno apropiado del hidrolizado procedente de la etapa (2) y la obtención de un mosto de fermentación; y 4) la separación del microorganismo alcoholígeno utilizado en la etapa (3) , la separación/purificación del etanol y la obtención de una fase acuosa que constituye un residuo, donde se utiliza el residuo constituido por los vinotes de destilación, tras la separación del etanol, como fuente de carbono inductora o total para la producción de dichas enzimas celulolíticas .

2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde dicho residuo es utilizado como fuente de carbono para el crecimiento del microorganismo celulolítico y la producción de enzimas celulolíticas.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, donde el residuo es utilizado como fuente de carbono inductora complementaria de otras fuentes de carbono utilizadas para el crecimiento del microorganismo celulolítico.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, donde el residuo es utilizado como única fuente de carbono para el crecimiento del microorganismo celulolítico y la producción de enzimas celulolíticas.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, donde los materiales celulósicos o lignocelulósicos son seleccionados entre las pajas, la madera, los cultivos forestales, los residuos alcoholígenos de plantas, azucareros y de cereales, los residuos de la industria papelera y los productos de transformación de los materiales celulósicos y lignocelulósicos.