Polipéptidos que tienen una actividad en la vía de degradación del metil-terc.butil-éter (MTBE) y sus utilizaciones.

Polipéptido aislado o purificado que tiene una actividad en la vía de degradación del MTBE,

y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en el alcohol tercbutílico (TBA), el 2-metil-1, 2-propanodiol (2-M-1, 2-PD), el hidroxiisobutiraldehído y el ácido hidroxiisobutírico (HIBA), seleccionándose dicho polipéptido del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:10,

b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta al menos 70 % de identidad, preferentemente 75%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que comprende la SEQ ID NO:2, el polipéptido tal como el definido en a) o b) de la secuencia SEQ ID NO:2 que tiene une actividad de deshidrogenación del hidroxiisobutiraldehído a HIBA, y el polipéptido tal como el definido en a) de la secuencia SEQ ID NO:10 que tiene una actividad de regulador transcripcional

Polipéptidos que tienen una actividad en la vía de degradación del metil-terc.butil-éter (MTBE) y sus utilizaciones.

La presente solicitud se refiere al dominio de la microbiología, y más particularmente a la utilización de microorganismos para tratar efluentes contaminados por contaminantes químicos, principalmente el metil-terc-butiléter (MTBE) y/o intermedios catabólicos de este compuesto.

La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos y sus fragmentos, así como a los ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos aislados de microorganismos capaces de metabolizar el MTBE, y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente el alcohol terc-butílico (TBA) , el 2-metil-1, 2-propanodiol (2-M-1, 2-PD) , el hidroxiisobutiraldehído, el ácido hidroxiisobutírico (HIBA) . La invención se refiere igualmente a vectores de clonación y/o de expresión que comprenden dichos ácidos nucleicos, células bacterianas transformadas por dichos ácidos nucleicos o dichos vectores, así como sus utilizaciones.

La invención se refiere igualmente a un procedimiento de identificación de microorganismos capaces de metabolizar el MTBE, y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE. Más particularmente, la presente invención se refiere a una nueva cepa bacteriana, Mycobacterium austroafricanum, registrada en la colección CNCM bajo el número I-3401.

La invención se refiere igualmente a un procedimiento de tratamiento de efluentes contaminados por el MTBE y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE.

El compuesto químico MTBE se utiliza como aditivo en las gasolinas sin plomo. Desde que está prohibida la utilización de los alquil- plomo debido a su toxicidad, el MTBE se añade a las gasolinas con el fin de aumentar su índice de octano. El índice de octano mide la "resistencia al cascabeleo o picado" de los carburantes cuando se queman mezclados con aire en la cámara de combustión de los motores. El MTBE se utiliza igualmente como compuesto oxigenado que permite aumentar el contenido en oxígeno de las gasolinas, y por esto, mejorar su eficacia de combustión. Esto permite reducir la expulsión a la atmósfera de los hidrocarburos no quemados, así como el de monóxido de carbono. Así, concentraciones de MTBE de 15% (v/v) se utilizan corrientemente en los carburantes oxigenados. El MTBE ha sido clasificado como compuesto cancerígeno potencial par la agencia de EE.UU. para la protección de medio ambiente (US E.P.A., Decembre 1997 EPA/822/F-97/008. Office of Water, Washington, DC, USA) . La contaminación por este compuesto del medio ambiente puede ser debida al almacenamiento inadecuado de la gasolina en los depósitos no estancos o a vertidos accidentales. Este tipo de residuos puede causar serios problemas de contaminación medioambiental, tal como la contaminación de los acuíferos subterráneos. Los consumidores pueden estar expuestos a débiles concentraciones cuando beben un agua no potable procedente de una fuente contaminada por el MTBE. Por otra parte, el gusto o sabor desagradables que el MTBE confiere al agua, incluso a débiles concentraciones, la hace inapropiada para el consumo, haciendo de este compuesto xenobiótico un contaminante importante. La contaminación por el MTBE parece ser principalmente atribuible al hecho de que sea eliminado difícilmente del medio ambiente. El MTBE se revela persistente por su elevada solubilidad en el agua y su débil biodegradabilidad. La semi-vida del MTBE en los acuíferos se estima en al menos 2 años (Wilson J. T., 2003, 19-61: In E. E. Moyer and P. T. Kostecki (ed.) , MTBE Remediation Handbook. Amherst Scientific Publishers, Amherst, MA.) ; este valor se puede comparar con el del benceno que es de 2 a 3 meses en condiciones idénticas. La contaminación de los acuíferos puede engendrar serios riesgos para la salud pública. Por tanto es necesario desarrollar procedimientos eficaces que permitan tratar los acuíferos contaminados por el MTBE o cualquier otro intermedio catabólico del MTBE.

Desde hace algunos años se han emprendido varios estudios tendentes a determinar la biodegradabilidad del MTBE. Se han identificado y aislado cierto número de microorganismos capaces de asimilar completamente o parcialmente el MTBE. Por ejemplo, ciertos microorganismos son capaces de catabolizar el MTBE por cometabolismo. Dos vías de degradación, que implican las dos la oxidación inicial del MTBE, conducen a la producción del alcohol terc.butílico (TBA) que, más generalmente se acumula en el medio. La cepa bacteriana Mycobacterium vaccae JOB5, cuando se cultiva sobre propano es capaz de oxidar el TBA aunque esto no permita generar compuestos útiles para su crecimiento. Se han podido aislar algunas cepas de microorganismos capaces de asimilar el MTBE como fuente de carbono y de energía (François et al., Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68: 2754-2762; Hanson, J. R., et al. Appl. Environ. Microbiol., 1999. 65: 4788-4792 Hatzinger, P. B., et al., Appl. Environ. Microbiol., 2001, 67: 5601-5607) . Todavía no han sido aclarados los mecanismos enzimáticos del ataque inicial del MTBE en estas bacterias.

La cepa bacteriana Mycobacterium austroafricanum I-2562 es una de las bacterias conocidas por su capacidad de crecer en condiciones aerobias, en presencia del MTBE. Esta cepa es en efecto capaz de catabolizar el MTBE en fuente de carbono y de energía (François et al., Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68: 2754-2762; patente de EE. UU. nº 6.849.445) . Se han identificado cierto número de intermedios de degradación o catabolitos del MTBE, tales como el TBA, el 2-M-1, 2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA. La vía de degradación del MTBE para esta cepa bacteriana está descrita en la Figura 1.

La cinética de degradación del MTBE y del crecimiento que le acompaña en M. austroafricanum I-2562 presenta dos fases bien distintas (Figura 2) . La cinética de degradación del MTBE se caracteriza por una velocidad de degradación muy rápida en el curso de las primeras 48 horas, que disminuye del día 2º al 16º. Durante esta etapa de transformación del MTBE en TBA, el TBA se acumula y por tanto no se observa ningún crecimiento. Del día 16º al 21º, el TBA acumulado se degrada induciendo al crecimiento del microorganismo.

Hay que advertir que la primera etapa de degradación comprende Ia mineralización del formiato en CO2 lo que necesita que el microorganismo sea metilótrofo (François et al., Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68: 2754-2762) . La formiato- deshidrogenasa dependiente de NAD (P) + (o FDH) es una enzima que desempeña un papel importante en la producción de energía en los microorganismos metilótrofos. Esta enzima, es por otra parte, frecuentemente utilizada en la regeneración del cofactor del tipo NAD (P) + en las reacciones de biocatálisis (Tishkov, V. I. et al. Biochemistr. (Moscú) , 2004, 69: 1537-1554) . Esta primera etapa del catabolismo no genera ATP. François et al., han mostrado que el TBF tenía un efecto negativo sobre la velocidad de degradación del MTBE en M. austroafricanum I2562 (François et al., App Microbiol. Biotechnol. 2003, 62: 256-262) . Se ha sugerido que el déficit en equivalentes reducidos de coenzimas y en energía era igualmente responsable de la ralentización de las reacciones enzimáticas (Salanitro, Curr. Op. Biotechnol., 1995, 6: 337-340) . Estas dos razones son probablemente las responsables principales de la ralentización de la velocidad de degradación del MTBE.

La segunda etapa, al permitir la producción neta de 2 NAD (P) H y de 2H+, alimenta así la cadena de transporte de electrones con el O2 como aceptor final de electrones en aerobiosis. Esta etapa parecería pues esencial en el metabolismo del MTBE. El resultado final de esta cadena de transporte de electrones es regenerar el NAD (P) + a partir del NAD (P) H, reducir el O2 a H2O, creando un gradiente de transporte de protones que se utilizan para la formación de ATP por la ATP -sintasa (bomba de protones) . Esto corresponde al mecanismo de fosforilación oxidante y permite la síntesis de ATP que es el compuesto energético de los microorganismos (30, 5 kJ producto/mol de ATP degradado debido a un enlace de alto nivel energético) .

Un objetivo de la invención es disponer de polipéptidos capaces de metabolizar el MTBE, y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente el TBA, el 2-M-1, 2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA, y eventualmente modificarlos y utilizarlos con el fin de tratar efluentes contaminados por el MTBE, y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente el TBA, el... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido aislado o purificado que tiene una actividad en la vía de degradación del MTBE, y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en el alcohol tercbutílico (TBA) , el 2-metil-1, 2-propanodiol (2-M-1, 2-PD) , el hidroxiisobutiraldehído y el ácido hidroxiisobutírico (HIBA) , seleccionándose dicho polipéptido del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:10,

b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta al menos 70 % de identidad, preferentemente 75%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que comprende la SEQ ID NO:2, el polipéptido tal como el definido en a) o b) de la secuencia SEQ ID NO:2 que tiene une actividad de deshidrogenación del hidroxiisobutiraldehído a HIBA, y

el polipéptido tal como el definido en a) de la secuencia SEQ ID NO:10 que tiene una actividad de regulador transcripcional

2. Ácido nucleico purificado o aislado, caracterizado porque codifica al menos un polipéptido según la reivindicación

1.

3. Ácido nucleico aislado o purificado que codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad en la vía de degradación del MTBE, o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente el TBA, el 2-M-1, 2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA, seleccionado del grupo que consiste en :

e) un ácido nucleico que comprende al menos una cualquiera de las secuencias nucleotídicas seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:9, o un complemento de estas,

f) un ácido nucleico que comprende al menos una secuencia nucleotídica que presenta al menos 70 % de identidad, preferentemente 75%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad con la secuencia nucleotídica de un ácido nucleico tal como el definido en e) .

4. Ácido nucleico, caracterizado porque comprende la secuencia nucleotídica SEQ ID NO:11.

5. Ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque su transcripción está bajo el control de un promotor único.

6. Ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque su transcripción está inducida por la presencia de MTBE, y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en el TBA, el 2-M-1, 2-PD, el hidroxiisobutraldehído y el HIBA.

7. Ácido nucleico según la reivindicación 6, caracterizado porque está organizado en operón.

8. Polipéptido según la reivindicación 1 o ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado porque es aislado y purificado de una cepa bacteriana elegida entre las cepas Mycobacterium austroafricanum registradas en la colección CNCM bajo los números I-3401 y I-2562.

9. Ácido nucleico recombinante, caracterizado porque comprende un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.

10. Vector caracterizado porque comprende un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9.

11. Célula hospedante aislada que comprende bien al menos uno de los ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, o bien al menos uno de los vectores según la reivindicación 10.

12. Procedimiento de identificación de una célula o de un ácido nucleico de una célula susceptible de degradar el MTBE y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en el TBA, el 2-M-1, 2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA, que comprende:

- opcionalmente una etapa de siembra de la célula sobre el medio suplementado en MTBE y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en el TBA, el 2-M-1, 2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA,

- una etapa de cribado de los ácidos nucleicos de dicha célula por hibridación con al menos una sonda, comprendiendo dicha sonda la secuencia nucleotídica complementaria de un fragmento de al menos 50 nucleótidos consecutivos de la secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:9, o comprendiendo dicha secuencia un fragmento del gen mpdB de 591 pares de bases que tiene la secuencia SEQ ID NO: 14.

13. Cepa bacteriana Mycobacterium austroafricanum registrada en la colección CNCM bajo el número I-3401.

14. Utilización del polipéptido de la SEQ ID NO:2 según la reivindicación 1, para la deshidrogenación del hidroxiisobutiraldehído a HIBA.

15. Procedimiento de tratamiento de efluentes acuosos que comprenden MTBE, ETBE y/o al menos uno de los intermedios catabólicos del MTBE, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en el TBA, el 2-M-1, 2-PD, el hidroxiisobutiraldehído y el HIBA, con el fin de reducir su concentración, caracterizado porque comprende la siembra de dicho efluente acuoso por al menos une célula según una cualquiera de las reivindicaciones 11 o 13 o identificada por el procedimiento según la reivindicación 12.