Procedimientos de producción de ácido succínico.

Procedimiento de producción de ácido succínico y/o de iones succinato por fermentación en condicionesanaerobias de una cepa de Escherichia coli,

que comprende:

(A) una etapa de fermentación de una fuente de carbono en un fermentador, con aporte de CO2, realizadacon los conductos de ventilación del fermentador cerrados de manera que el aporte de CO2 esté sometidoal consumo de CO2 por la cepa; seguida, antes del agotamiento total de la fuente de carbono, de

(B) una etapa de fermentación de la fuente de carbono restante, sin aporte de CO2, a fin de consumir elCO2 residual.

Procedimientos de producción de ácido succínico

La presente invención se refiere a procedimientos de producción de ácido succínico y/o de iones succinato mediante fermentación en condiciones anaerobias.

El ácido succínico (o ácido butanodioico) es un ácido orgánico con dos grupos carboxilos, de fórmula semidesarrollada COOH-CH2-CH3-COOH, que interviene en el metabolismo celular, como intermediario metabólico del ciclo de Krebs en la mitocondria.

Se encuentra en numerosas aplicaciones en los campos cosméticos, agroalimentarios, farmacéuticos, textiles y en los plásticos. Así, se utiliza por ejemplo como intermediario de síntesis de los plásticos para la fabricación de 1, 4butanodiol, de tetrahidrofurano y de gamma-butirolactona.

Nuevos productos derivados del ácido succínico están en constante desarrollo, incluyendo el desarrollo de poliésteres.

Generalmente, los ésteres del ácido succínico tienen el potencial de ser nuevos disolventes "verdes" que pueden sustituir los disolventes más perjudiciales para el ser humano y el medioambiente.

La producción de ácidos carboxílicos, tales como el ácido málico, el ácido succínico o el ácido fumárico, a partir de materias primas renovables (en este caso a través de los procesos de fermentación) es conocida por el experto en la materia.

El succinato es un intermediario metabólico durante la fermentación anaerobia por unas bacterias que producen propionato, pero estos procedimientos de fermentación resultan de la producción de muy bajos rendimientos y títulos de ácido succínico.

Estos últimos años, muchos microorganismos productores de ácido succínico han sido aislados, como por ejemplo las bacterias anaerobias de la panza, Bacteroides ruminicola y Bacteroides amylophilus. Sin embargo, los organismos de la panza son muy inestables durante los procedimientos de fermentaciones, y no son por lo tanto utilizables de manera industrial para la producción de ácido succínico.

Se sabe desde hace mucho tiempo que una mezcla de varios ácidos, entre ellos el ácido succínico, es producida a partir de la fermentación de E. coli en presencia de glucosa y de CO2 como sustratos carbonados, como se describe por JL Stokes en 1949 «Fermentation of glucose by suspensions of Escherichia coli» J. Bacteriol., 57; 147-158. Sin embargo, por cada mol de glucosa fermentada, se producen sólo de 0, 3 a 0, 4 moles de ácido succínico. Se realizaron por lo tanto unos estudios sobre unas bacterias, en particular Escherichia coli. modificadas genéticamente a fin de inactivar las vías metabólicas que consumen el NADH necesario para la fabricación del ácido succínico y a fin de activar las vías metabólicas de producción del succinato (sal del ácido succínico) .

En efecto, el camino metabólico fermentario que permite la conversión del oxaloacetato en malato, después en fumarato, y finalmente en succinato necesita dos moles de NADH por mol de succinato producido. El mayor bloqueo metabólico para la producción de succinato es por lo tanto la biodisponibilidad celular en NADH.

Para solucionar esta dificultad, el documento US 7.223.567 describe la utilización de una cepa de Escherichia coli. recombinante superproductora de succinato para la misma cantidad de NADH disponible.

Esta cepa de Escherichia coli. SBS550 MG pHL 413 presenta una inactivación de los productos de los genes adhE, ldhA (implicados en las vías consumidoras de NADH) , y una inactivación de los productos de los genes ack-pta y del gen iclR (que activa la vía glioxilato) , y contiene un vector plasmídico que sobreexpresa un gen PYC exógeno. El artículo de Sanchez et al. (titulado «Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinate yield and productivity» en Metabolic Engineering 7 (2005) 229-239) , la patente Americana US 7 223 567 y la solicitud de patente Americana US 2005/0042736 han desarrollado nuevas condiciones de cultivo y de producción asociadas a esta cepa para mejorar sus rendimientos de producción en ácido succínico.

El experto en la materia investiga constantemente nuevos procedimientos mejorados de producción de ácido succínico. En particular, el experto en la materia busca optimizar el rendimiento y la productividad obtenidos. Por otra parte, los métodos de fermentación clásicos conducen a importantes emisiones de dióxido de carbono en la atmósfera, lo que es muy evidentemente poco deseable.

Según un aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de ácido succínico y/o de iones succinato mediante fermentación anaerobia de una cepa de Escherichia coli, que comprende:

(A) una etapa de fermentación de una fuente de carbono en un fermentador, con aporte de CO2, realizada con los conductos de ventilación del fermentador cerrados de manera que el aporte de CO2 esté sometida al consumo de CO2 por la cepa; seguida, antes del agotamiento total de la fuente de carbono, de

(B) una etapa de fermentación de la fuente de carbono restante, sin aporte de CO2, a fin de consumir el CO2 residual.

El experto en la materia está familiarizado con las técnicas de fermentación (tales como la particularmente descrita en Fermentation & Biochemical Engineering Handbook: princip/es, process design & equipment, 2ª ed. 1996 de VOGEL Henr y C. y TODARO Celeste L.) .

La fermentación es una reacción bioquímica que consiste generalmente en liberar energía, o en producir ciertos metabolitos de interés a partir de un sustrato orgánico bajo la acción de enzimas microbianas.

La fermentación se lleva a cabo generalmente en unos dispositivos (fermentadores) adaptados al proceso de fermentación, es decir adaptados al cultivo de microorganismos en las condiciones deseadas (dispositivo que permite, llegado el caso, controlar los equilibrios gaseosos del medio de cultivo, en particular por unos conductos de entrada y/o de salida de gas, conductos de ventilación, etc.; dispositivos que permiten la introducción de medio de cultivo y otras sustancias; dispositivos que permiten controlar, regular, o modificar otros tipos de parámetros, tales como la agitación, la temperatura, el pH, etc.) .

El experto en la materia está también familiarizado con la fermentación en condiciones anaerobias. Según la presente invención, esto designa unas condiciones de cultivo en ausencia de oxígeno. De manera preferida, unas condiciones de cultivo anaerobias son unas condiciones de cultivo en presencia de dióxido de carbono. Según un modo de realización, las condiciones de fermentación anaerobias en presencia de CO2 y/o con aporte de CO2 son unas condiciones de fermentación en saturación de CO2.

Por "antes del agotamiento total de la fuente de carbono" durante la etapa (A) , se entiende un instante de la etapa

(A) en el que el medio de fermentación contiene una cantidad residual de fuente de carbono que puede ser integralmente transformada por la cepa de ácido succínico y/o de succinato gracias al CO2 disponible en disolución en este instante (en forma de CO2, disuelto o de HCO3-) .

Durante la etapa (A) , estando cerrado (s) el o los conductos de ventilación del fermentador y siendo la alimentación en CO2 del fermentador mantenida, el aporte de CO2 se realiza de manera discontinua, automáticamente ajustado en función del consumo de CO2 por la cepa para la producción de ácido succínico y/o de succinato.

Por "automáticamente ajustado" se entiende, teniendo en cuenta el equilibrio termodinámico entre la fase líquida (medio de fermentación) y la fase gaseosa ("atmósfera") presentes en el fermentador (conducto (s) de ventilación cerrado (s) ) , que el aporte de una cantidad dada de CO2 puede intervenir sólo después del consumo de una cantidad equivalente por la cepa por fermentación (y por lo tanto la producción concomitante de ácido succínico y/o de succinato) .

Durante la etapa (B) , no hay aporte de CO2, lo que significa que el aporte de CO2 realizado durante la etapa (A) es interrumpido. Esto se puede realizar en particular mediante corte en la alimentación de CO2.

Ventajosamente, según la invención, la fermentación durante la etapa (B) consume el CO2 (residual disuelto) y los iones HCO3- presentes en el medio de fermentación.

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1. Procedimiento de producción de ácido succínico y/o de iones succinato por fermentación en condiciones anaerobias de una cepa de Escherichia coli, que comprende:

(A) una etapa de fermentación de una fuente de carbono en un fermentador, con aporte de CO2, realizada con los conductos de ventilación del fermentador cerrados de manera que el aporte de CO2 esté sometido al consumo de CO2 por la cepa; seguida, antes del agotamiento total de la fuente de carbono, de

(B) una etapa de fermentación de la fuente de carbono restante, sin aporte de CO2, a fin de consumir el CO2 residual.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que, al principio de la etapa (A) , el medio de fermentación está saturado de CO2.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la etapa (A) y/o la etapa (B) se desarrolla a un pH en un intervalo de 6, 0-7, 0.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la etapa (A) y/o la etapa (B) se desarrolla a un pH de 6, 4-6, 8.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la fuente de carbono es la glucosa, y en el que:

- al principio de la etapa (A) , el medio de fermentación comprende 15-40 g/l de glucosa, y

- al principio de la etapa (B) , el medio de fermentación comprende 2-6 g/l de glucosa.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la cepa de Escherichia coli posee el genotipo fadhE fldh4 ficlR fackpta PYC.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque la cepa de Escherichia coli es la cepa SBS550MG pHL413.

8. Procedimiento de obtención de un ácido succínico, que comprende:

- un procedimiento de producción de ácido succínico y/o de iones succinato según cualquiera de las reivindicaciones 1-7;

- llegado el caso, una acidificación de los iones succinato en ácido succínico; y

- una etapa de purificación del ácido succínico; y - opcionalmente, una etapa de cristalización del ácido succínico.

9. Procedimiento de obtención de ácido succínico según la reivindicación 8, caracterizado porque la etapa de purificación del ácido succínico es una purificación etanólica.