Un procedimiento para analizar los metabolitos de una muestra biológica que comprende determinarcuantitativamente al menos 50 metabolitos en dicha muestra en un modo que dicha determinación cuantitativaresuelva diferencias de masas isotópicas dentro de un metabolito,

estando caracterizado dicho procedimiento porque la muestra comprende o se deriva de una célula que se hamantenido en condiciones que permiten la captación de un compuesto metabolizable marcado isotópicamente de talforma que los metabolitos en dicha célula estén saturados con el isótopo con el que dicho compuesto metabolizableestá marcado en que la proporción del isótopo de marca de al menos 50 metabolitos de la muestra biológica estáincrementado a al menos el 80 % del total de todos los isótopos del elemento, en el que dichos al menos 50metabolitos comprenden azúcares, alcoholes de azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos, ácidos grasos, vitaminas,esteroles, fosfatos, poliaminas, polioles, nucleósidos, adenina, etanolamina, ácido nicotínico, uracilo y/o urea y en elque dichos metabolitos no son ADN, ARN o proteínas.

Procedimiento para analizar metabolitos La presente solicitud se refiere a un procedimiento para analizar los metabolitos de una muestra biológica que comprende determinar cuantitativamente al menos 50 metabolitos en dicha muestra en un modo que dicha determinación cuantitativa resuelva diferencias de masas isotópicas dentro de un metabolito, caracterizándose dicho procedimiento porque la muestra comprende o se deriva de una célula que se ha mantenido en condiciones que permiten la captación de un compuesto metabolizable marcado isotópicamente de tal forma que los metabolitos en dicha célula se saturen con el isótopo el que con dicho compuesto metabolizable está marcado en que la proporción del isótopo de marca de al menos 50 metabolitos de la muestra biológica se incrementa hasta al menos el 80 % del total de todos los isótopos del elemento, en el que dichos al menos 50 metabolitos comprenden azúcares, alcoholes de azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos, ácidos grasos, vitaminas, esteroles, fosfatos, poliaminas, polioles, nucleósidos, adenina, etanolamina, ácido nicotínico, uracilo y/o urea y en el que dichos metabolitos no son ADN, ARN o proteínas. Este procedimiento puede comprender adicionalmente, antes de determinar cuantitativamente los metabolitos, combinar la muestra biológica (es decir, la primera muestra biológica) con una segunda muestra biológica en la que los metabolitos no están marcados isotópicamente o están marcados isotópicamente de forma diferente a partir de su muestra biológica; y determinar en dichas muestras biológicas las cantidades relativas de metabolitos que difieren por su por su marca isotópica. También se revelan conjuntos de metabolitos marcados isotópicamente obtenibles aplicando este procedimiento, así como kits para facilitar la aplicación de este procedimiento y para los usos correspondientes.

La presente invención pertenece al campo de los análisis de metaboloma, también referido como de perfiles metabólicos, es decir el análisis cuantitativo de metabolitos en una muestra biológica con el propósito de investigar el estado de los organismos en particular con respecto a las redes reguladoras bioquímicas. En la técnica anterior, el metaboloma, además del proteoma, el transcriptoma y el genoma, ha llegado a ser la cuarta piedra angular de los análisis de sistemas biológicos. Solamente los análisis de metaboloma permiten entendimiento del uso de nutrientes, la capacidad biosintética de los organismos, la señalización y la comunicación mediada por medio de compuestos de bajo peso molecular y los procedimientos adaptativos bioquímicos. Por lo tanto se demandan análisis de perfiles de los cambios relativos de todos los metabolitos dentro de un organismo para un análisis de sistemas biológicos verdaderos.

Los análisis de metaboloma están aún en desarrollo temprano entre otras cosas porque, en contraste con los análisis de genoma, de transcriptoma y de proteoma, los análisis de metaboloma tienen que ocuparse de un intervalo de productos químicos altamente diversos que abarca sustancias desde volátiles de bajo peso molecular pequeños hasta polímeros. Convencionalmente, se usan plataformas diferentes y especializadas con el fin de analizar estas clases diferentes de compuestos. Mientras tanto, se han desarrollado plataformas analíticas aplicables universalmente para mezclas complejas de compuestos. Estas explotan masa molecular y retención cromatográfica en las así llamadas tecnologías compuestas, como CG-EM, HPLC-EM o MALDI-TOF. La cromatografía de gases de mesa acoplada a la espectrometría de masas (CG-EM) fue la primera plataforma tecnológica propuesta para análisis de metaboloma a gran escala (Trethewey, 1999) . La elección de esta tecnología compuesta tuvo en cuenta la combinación ideal de separación cromatográfica insuperable con la selectividad alta, la sensibilidad alta y el intervalo dinámico de la detección de masas cuantitativa.. Además, tanto CG como espectrometría de masas por ionización de impacto electrónico (EI) presentan solamente efectos de matriz menores comparados con otras técnicas de EM, como por ejemplo desorción láser asistida por matriz/ionizaciónespectrometría de masas de dispersión (MALDI-TOF) (Guo, 2002) o cromatografía líquida acoplada a detección de masas (HPLC-EM) (Matuszewski, 2003) . La alta reproducibilidad de los análisis de CG-EM de metabolitos, que usan rutinariamente reactivos de clorhidrato de metoxiamina (MEOX) y de N-metil-N- (trimetilsilil) -trifluoroacetamida (MSTFA, permitieron perfil de metabolitos basado en cuantificación externa de los derivados respectivos de metoxiamina (MX) y trimetilsililo (TMS) (Fiehn, 2000a; Roessner, 2000; Roessner, 2001) . El alcance de los metabolitos abarcados está, sin embargo, limitado (1) por la volatilidad requerida de los metabolitos o derivados químicos estables de metabolitos inestables y (2) por la distribución de las concentraciones de metabolitos dentro de cada tipo de muestra. La carga de muestra máxima de cualesquiera análisis químicos multiparalelos se determina por los metabolitos predominantes. Los perfiles de metabolitos de CG-EM tienen un intervalo dinámico enorme de 4

o 5 órdenes de magnitud. El límite de cuantificación superior se ajusta por el requerimiento de reactivo químico en exceso y por efectos de deformación de pico debidos a sobrecarga cromatográfica. Así, las matrices biológicas desprovistas de metabolitos predominantes individuales prometen mejor potencial para análisis en multiparalelo altamente complejos (Fiehn, 2000a; Roessner, 2000) .

Son concebibles dos estrategias principales hacia análisis de metaboloma más exhaustivos: (1) la elección de otras técnicas analíticas que puedan suplementar los análisis de CG-EM y (2) la aplicación de técnicas de prefraccionamiento y concentración para el enriquecimiento de los compuestos traza. Sin embargo, ambas estrategias son actualmente muy limitadas. Técnicas de EM complementarias, como por ejemplo MALDI-TOF-EM o HPLC-EM, están sujetas a interferencias fuertes, que son el resultado de las composiciones cambiantes de matrices biológicas complejas. Estos así llamados efectos de matriz pueden conducir incluso a la supresión completa de ionización y de señal de respuesta (Matuszewski, 2003; Guo, 2002) . Por otro lado, la mayoría de las técnicas de prefraccionamiento y concentración dan como resultado pérdidas altas o altamente variables de metabolitos.

Estas desventajas que impiden el uso de técnicas de EM potencialmente más potentes en los estudios de perfiles de metabolitos pueden al menos en parte superarse incluyendo estándares internos en los análisis de metabolitos. En efecto, se requiere una estandarización cuantitativa minuciosa para cuantos metabolitos medidos sea posible. Esto permitiría ampliar el ámbito del perfil de metabolito a tales técnicas, debido a que ello permitiría una cuantificación exacta de los niveles de metabolitos para los que está disponible un estándar. A partir de las investigaciones sobre flujos metabólicos, se sabe que los metabolitos pueden marcarse in vivo con un isótopo estable (Wittmann, 2002) . Sin embargo, los análisis de flujo están generalmente confinados a la investigación de rutas bioquímicas muy limitadas y no abarcan metabolitos en la amplitud que se requiere normalmente para perfil metabólico. En consecuencia, los compuestos de sustrato que se usan en tales estudios con el fin de marcar células con un isótopo estable son típicamente muy específicos para la ruta bioquímica particular a analizarse. Su producción es cara porque requiere síntesis química específica y prolija.

Para resumir, un enfoque factible para establecer un estándar cuantitativo para usar en realización de perfiles de metabolitos no se vislumbra en la técnica anterior. Esto se explica principalmente por la diversidad de las clases de compuestos a las que pueden pertenecer los metabolitos y por el hecho de que la mayoría de los metabolitos no se puede marcar después de la extracción tal como es posible para los tránscritos y proteínas químicamente uniformes (véase, por ejemplo, Gygi, 1999) .

Así, el problema técnico que subyace a la presente invención es el suministro de medios y procedimientos que permitan mejorar los análisis de metabolomas estableciendo un estándar cuantitativo fiable para cuantos metabolitos sea posible con el fin de ampliar el alcance de tales análisis.

Este problema técnico se soluciona por el suministro de las realizaciones según se caracterizan en las reivindicaciones.

De acuerdo con ello, la presente solicitud se refiere... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para analizar los metabolitos de una muestra biológica que comprende determinar cuantitativamente al menos 50 metabolitos en dicha muestra en un modo que dicha determinación cuantitativa resuelva diferencias de masas isotópicas dentro de un metabolito,

estando caracterizado dicho procedimiento porque la muestra comprende o se deriva de una célula que se ha mantenido en condiciones que permiten la captación de un compuesto metabolizable marcado isotópicamente de tal forma que los metabolitos en dicha célula estén saturados con el isótopo con el que dicho compuesto metabolizable está marcado en que la proporción del isótopo de marca de al menos 50 metabolitos de la muestra biológica está incrementado a al menos el 80 % del total de todos los isótopos del elemento, en el que dichos al menos 50 metabolitos comprenden azúcares, alcoholes de azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos, ácidos grasos, vitaminas, esteroles, fosfatos, poliaminas, polioles, nucleósidos, adenina, etanolamina, ácido nicotínico, uracilo y/o urea y en el que dichos metabolitos no son ADN, ARN o proteínas.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que al menos el 50 % de los metabolitos de la muestra biológica a analizarse contienen la marca isotópica.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, que comprende adicionalmente, antes de la determinación cuantitativa de los metabolitos, combinar la muestra biológica (es decir, la primera muestra biológica) con una segunda muestra biológica en la que los metabolitos no están marcados isotópicamente o están marcados isotópicamente de forma diferente a partir de la primera muestra biológica; y determinar en dichas muestras biológicas la cantidad relativa de metabolitos que son diferentes por su marca isotópica.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la primera y la segunda muestras biológicas corresponden a diferentes estados fenotípicos y/o genotípicos de las células comprendidas en las muestras o de las que se derivan las muestras.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que los diferentes estados fenotípicos y/o genotípicos son diferentes fases de desarrollo, entornos, suministros alimentarios, unidades taxonómicas, genomas de tipo silvestre y genomas mutantes o transgénicos, estados infectados y no infectados, estados morbosos y sanos o fases diferentes de una patogenicidad.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en las que el isótopo es 13C, 15N, 18O o 2H.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el compuesto metabolizable marcado isotópicamente es U-13C-glucosa, 2H2O, H218O, U-13C-ácido acético.

13. carbonato .

13. ácido carbónico.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la muestra biológica comprende células de levadura o células vegetales.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende adicionalmente fraccionar

o purificar la muestra biológica de tal forma que la muestra contenga un subconjunto de los metabolitos contenidos en la célula de la que la muestra se deriva.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que los metabolitos se determinan cuantitativamente por espectrometría de masas.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la espectrometría de masas es MALDI-TOF.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que los metabolitos están cromatográficamente separados antes de la determinación cuantitativa.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende adicionalmente la etapa de introducir estándares externos para uno o más de los metabolitos determinados cuantitativamente.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende adicionalmente la etapa de identificar uno o más de los metabolitos que se determinan cuantitativamente.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dichos metabolitos se identifican por fragmentación secundaria.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la identificación de dichos metabolitos comprende ionización de impacto electrónico, tecnología de EM-EM y/o análisis después de la declinación de la fuente de iones moleculares o fragmentos.

17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicha célula se ha mantenido en condiciones que permiten adicionalmente la captación de un compuesto metabolizable no marcado isotópicamente y dicho compuesto y/o dichos productos metabólicos del mismo se determinan cuantitativamente.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que la cantidad determinada para el compuesto metabolizable no marcado isotópicamente y/o para dichos productos metabólicos del mismo se compara con la cantidad obtenida llevando a cabo dicho procedimiento en la misma medida, pero sin la captación de dicho compuesto metabolizable no marcado.

19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que, además de los metabolitos, una o más proteínas y/o tránscritos en dicha (s) muestra (s) se determina (n) y se analiza (n) cuantitativamente.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dichos metabolitos y proteínas y/o tránscritos se determinan cada uno a partir de la misma muestra biológica.

21. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que dicho análisis implica

adicionalmente evaluación estadística y análisis de correlación adecuados de los datos obtenidos y opcionalmente, análisis de redes.

22. Uso de un compuesto marcado isotópicamente que se puede metabolizar por una célula, para marcar al menos 50 metabolitos en dicha célula en una manera saturante en que la proporción del isótopo de marca de al menos 50 metabolitos de la muestra biológica se incrementa a al menos el 80 % del total de todos los isótopos del elemento, en el que dichos al menos 50 metabolitos comprenden azúcares, alcoholes de azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos, ácidos grasos, vitaminas, esteroles, fosfatos, poliaminas, polioles, nucleósidos, adenina, etanolamina, ácido nicotínico, uracilo y/o urea y en el que dichos metabolitos no son ADN, ARN o proteínas.

Figura 1

Figura 4B

Figura 4F

273 Figura 4G

274 Figura H

Figura 4j

Figura 6 Figura 7