Un procedimiento para preparar un conjugado anticuerpo-maitansinoide,

que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un anticuerpo con un reactivo de reticulación bifuncional para unir covalentemente un enlazador al anticuerpo y preparar de este modo una primera mezcla que comprende anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos,

(b) someter la primera mezcla a filtración de flujo tangencial, precipitación selectiva, filtración adsortiva, o una resina de cromatografía adsortiva y preparar de este modo una primera mezcla purificada de anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos,

(c) conjugar un maitansinoide con los anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos en la primera mezcla purificada haciendo reaccionar los anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos con un maitansinoide en una solución que tiene un pH de 4 a 9 para preparar una segunda mezcla que comprende (i) anticuerpo acoplado químicamente mediante el enlazador al maitansinoide, (ii) maitansinoide libre y (iii) subproductos de reacción, y

(d) someter la segunda mezcla a una filtración de flujo tangencial para purificar los anticuerpos acoplados químicamente mediante los enlazadores al maitansinoide de los otros componentes de la segunda mezcla y preparar de este modo una segunda mezcla purificada de anticuerpos acoplados químicamente mediante los enlazadores al maitansinoide.

Procedimiento para preparar conjugados de fármaco purificados.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento para preparar conjugados de pureza y estabilidad sustancialmente altas, en donde los conjugados comprenden un anticuerpo acoplado químicamente a un maitansinoide.

Antecedentes de la invención

El tratamiento del cáncer ha progresado significativamente con el desarrollo de productos farmacéuticos que acceden y matan más eficazmente a las células cancerosas. Para este fin, los investigadores han aprovechado receptores superficiales celulares y antígenos expresados selectivamente por las células cancerosas para desarrollar fármacos basados en anticuerpos que se unen a los antígenos específicos de tumores o asociados a tumores. A este respecto, moléculas citotóxicas tales como toxinas de bacterias y plantas, radionúclidos y ciertos fármacos quimioterapéuticos han sido enlazados químicamente a anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos superficiales celulares específicos de tumores o asociados a tumores (véanse, p.ej., las solicitudes de patente internacionales WO 00/02587, WO 02/060955 y WO 02/092127, las patentes de EE.UU. 5.475.092,

6.340.701 y 6.171.586, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. Nº 2003/004210 A1, y Ghetie et al., J. Immunol. Methods, 112: 267-277 (1988) ) . Tales compuestos se denominan típicamente “conjugados” de toxinas, de radionúclidos y de fármacos, respectivamente. A menudo, también se denominan inmunoconjugados, radioinmunoconjugados, e inmunotoxinas. La muerte de la células tumorales se produce tras la unión del conjugado de fármaco a una célula tumoral y la liberación y/o activación de la actividad citotóxica del fármaco. La selectividad proporcionada por los conjugados de fármaco minimiza la toxicidad hacia las células normales, aumentando de este modo la tolerabilidad del fármaco en el paciente.

Se han descrito previamente procedimientos para conjugar anticuerpos a agentes citotóxicos que contienen sulfhidrilo tales como maitansinoides (véanse, p.ej., las patentes de EE.UU. 5.208.020, 5.416.064 y 6.441.163 y las solicitudes de patente internacionales WO 03/057163 y WO 02/098897) . Por ejemplo, las patentes de EE.UU.

5.208.020 y 5.416.064 describen un procedimiento para fabricar conjugados anticuerpo-maitansinoide en los que el anticuerpo se modifica primero con un reactivo heterobifuncional tal como se describe en las patentes EE.UU. 4.149.003, 4.563.304 y la publicación de solicitud de patente de EE.UU. Nº 2004/0241174 A1. Las patentes de EE.UU. 5.280.020 y 5.416.064 describen además la conjugación de un anticuerpo modificado con un exceso de un agente citotóxico que contiene sulfhidrilo a pH 7, seguido de la purificación en columnas de cromatografía SephadexTM G25. La purificación de conjugados anticuerpo-fármaco por cromatografía de exclusión de tamaños (SEC) también ha sido descrita (véase, p.ej., Liu et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) , 93: 8618-8623 (1996) y Chari et al., Cancer Research, 52: 127-131 (1992) ) .

Los procedimientos que se han descrito previamente para la preparación de los conjugados anticuerpo-fármaco son complejos, porque son obstaculizados con etapas que son incómodas de realizar o producen inmunoconjugados que son menos puros o menos estables que lo óptimamente deseado. Por ejemplo, la conjugación a un pH de entre 6, 0 y 6, 5 no es óptima para producir conjugados puros y estables. Además, las reacciones de conjugación bajo estas condiciones son generalmente lentas e ineficaces, conduciendo a un requisito de excesivo tiempo y utilización de material.

Sería deseable modificar o eliminar una o más etapas de preparación sin comprometer la calidad del producto, tal como la pureza y/o la estabilidad. Sería deseable además tener opciones de purificación adicionales que las que se han descrito hasta ahora, en la medida que algunas opciones serán más eficaces con ciertas combinaciones de agentes de unión a células, enlazadores y fármacos, que con otros.

En vista de lo anterior, hay una necesidad en la técnica de desarrollar métodos mejorados de preparación de composiciones de conjugados agente de unión a células-fármaco que sean de pureza sustancialmente alta y al mismo tiempo tengan mayor estabilidad.

Breve compendio de la invención

La invención proporciona un procedimiento para preparar un conjugado de pureza y estabilidad sustancialmente altas que comprende un agente de unión a células acoplado químicamente a un fármaco, en donde el agente de unión a células es un anticuerpo y el fármaco es un maitansinoide. El procedimiento comprende (a) poner en contacto un anticuerpo con un reactivo de reticulación bifuncional para unir covalentemente un enlazador al anticuerpo y preparar de este modo una primera mezcla que comprende anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos, (b) someter la primera mezcla a filtración de flujo tangencial, cromatografía adsortiva, filtración adsortiva, precipitación selectiva, o combinaciones de los mismos, y preparar de este modo una primera mezcla purificada de anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos, (c) conjugar un maitansinoide con los anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos en la primera mezcla purificada haciendo reaccionar los anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos con un maitansinoide en una solución que tiene un pH de 4 a 9 para preparar una segunda mezcla que comprende (i) anticuerpo acoplado químicamente mediante el enlazador al maitansinoide, (ii) maitansinoide libre y (iii) subproductos de reacción, y (d) someter la segunda mezcla a filtración de flujo tangencial, para purificar los anticuerpos acoplados químicamente mediante los enlazadores al maitansinoide de los otros componentes de la segunda mezcla y preparar de este modo una segunda mezcla purificada.

Descripción detallada de la invención

Se pueden usar conjugados agente de unión a células-fármaco de pureza y estabilidad sustancialmente altas para tratar enfermedades, debido a la alta pureza y estabilidad de los conjugados. Se describen composiciones que comprenden un anticuerpo acoplado químicamente a un maitansinoide en, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. Nº 2004/0241174 A1. En este contexto, se considera que pureza sustancialmente alta es: (a) más que 90%, preferiblemente más que 95% de las especies conjugadas son monoméricas, y/o (b) el nivel de fármaco libre en la preparación del conjugado es menor que 2% (relativo al fármaco total) .

A este respecto, el procedimiento inventivo comprende (a) modificar el anticuerpo con un reactivo de reticulación bifuncional para unir covalentemente un enlazador al anticuerpo y preparar de este modo una primera mezcla que comprende anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos, (b) someter la primera mezcla a filtración de flujo tangencial, cromatografía adsortiva, filtración adsortiva, precipitación selectiva, o combinaciones de los mismos, para purificar los anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos de otros componentes de la primera mezcla y preparar de este modo una primera mezcla purificada de anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos, (c) conjugar un maitansinoide con los anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos en la primera mezcla purificada haciendo reaccionar los anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos con un maitansinoide en una solución que tiene un pH de 4 a 9 para preparar una segunda mezcla que comprende (i) anticuerpo acoplado químicamente mediante el enlazador al maitansinoide, (ii) maitansinoide libre y (iii) subproductos de reacción, y (d) someter la segunda mezcla a filtración de flujo tangencial para retirar el maitansinoide no conjugado, los reaccionantes y los subproductos, así como para obtener conjugados anticuerpomaitansinoide sustancialmente purificados.

Preferiblemente, en la primera etapa de purificación se utiliza filtración de flujo tangencial (TFF, por sus siglas en ingles, también conocida como filtración de flujo cruzado, ultrafiltración y diafiltración) y/o resinas de cromatografía adsortiva. Se prefiere que la resina de cromatografía adsortiva sea una resina de intercambio no iónico. En otras realizaciones preferidas, se utiliza TFF en ambas etapas de purificación, o alternativamente, se utiliza una resina de cromatografía adsortiva en la primera etapa de purificación y se utiliza TFF en la segunda etapa de purificación. Se puede... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para preparar un conjugado anticuerpo-maitansinoide, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un anticuerpo con un reactivo de reticulación bifuncional para unir covalentemente un enlazador al anticuerpo y preparar de este modo una primera mezcla que comprende anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos,

(b) someter la primera mezcla a filtración de flujo tangencial, precipitación selectiva, filtración adsortiva, o una resina de cromatografía adsortiva y preparar de este modo una primera mezcla purificada de anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos,

(c) conjugar un maitansinoide con los anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos en la primera mezcla purificada haciendo reaccionar los anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos con un maitansinoide en una solución que tiene un pH de 4 a 9 para preparar una segunda mezcla que comprende (i) anticuerpo acoplado químicamente mediante el enlazador al maitansinoide, (ii) maitansinoide libre y (iii) subproductos de reacción, y

(d) someter la segunda mezcla a una filtración de flujo tangencial para purificar los anticuerpos acoplados químicamente mediante los enlazadores al maitansinoide de los otros componentes de la segunda mezcla y preparar de este modo una segunda mezcla purificada de anticuerpos acoplados químicamente mediante los enlazadores al maitansinoide.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la solución en la etapa (c) tiene un pH de 4 a 6, 0.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la solución en la etapa (c) tiene un pH de 6, 5 a 9.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la solución en la etapa (c) tiene un pH menor que 6, 0 o un pH mayor que 6, 5.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la solución en la etapa (c) comprende sacarosa.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la solución en la etapa (c) comprende además un agente amortiguador seleccionado del grupo que consiste en un tampón citrato, un tampón acetato, un tampón succinato y un tampón fosfato.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en huN901, huMy9-6, huB4, huC242, trastuzumab, bivatuzumab, sibrotuzumab, CNTO95, huDS6 y rituximab.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el anticuerpo es trastuzumab.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el maitansinoide comprende un grupo tiol.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el maitansinoide es DM1.

13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el maitansinoide es DM4.

14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que el anticuerpo se acopla químicamente al maitansinoide por medio de enlaces químicos seleccionados del grupo que consiste en enlaces disulfuro, enlaces lábiles con ácidos, enlaces fotolábiles, enlaces lábiles con peptidasa y enlaces lábiles con esterasa.

15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la primera mezcla se somete a filtración de flujo tangencial en la etapa (b) .