POLIPÉPTIDO CON DOMINIO DE KUNITZ MODIFICADO.

[0001] Las proteasas están implicadas en una amplia gama de rutas biológicas. En particular, las serinproteasas como calicreína, plasmina, elastasa, urocinasa activador de plasminógeno, trombina, inhibidor de coagulación asociado a lipoproteína humana y factores de coagulación como factores VIIa, IXa, Xa, XIa, y XIIa han estado implicadas en rutas que afectan al flujo sanguíneo, por ejemplo, isquemia general y focal, invasión tumoral, fibrinólisis, pérdida de sangre perioperatoria e inflamación. Los inhibidores de serinproteasas específicas, por tanto, han recibido atención como dianas farmacológicas potenciales para diversas enfermedades sistémicas. 15 [0002] Uno de estos inhibidores, la aprotinina (también denominada inhibidor de tripsina pancreática bovina o BPTI), obtenida del pulmón bovino, ha sido aprobado en los Estados Unidos para uso profiláctico para reducir pérdida de sangre perioperatoria y la necesidad de transfusión en pacientes que se someten a derivación cardiopulmonar (DCP), por ejemplo, en el curso de un procedimiento de injerto de derivación de la arteria coronaria. La aprotinina está disponible comercialmente con el nombre comercial de TRASYLOL® (Bayer Corporation 20 Pharmaceutical Division, West Haven, Connecticut) y fue aprobado anteriormente para su uso para tratar la pancreatitis. La eficacia de la aprotinina está asociada con sus capacidades relativamente inespecíficas para inhibir una variedad de serinproteasas, incluyendo calicreína plasmática y plasmina. Estas proteasas son importantes en una serie de rutas del sistema de activación de contacto (SAC). 25 [0003] El SAC es activado inicialmente cuando la sangre entera entra en contacto con la superficie de sustratos extraños (por ejemplo, caolín, vidrio, sulfato de dextrano o superficies óseas dañadas). La calicreína, una serinproteasa, es una enzima plasmática que inicia la cascada SAC que conduce a la activación de neutrófilos, plasmina, coagulación y diversas cininas. La calicreína es secretada como un cimógeno (precalicreína) que circula como una molécula inactiva hasta que es activada por un episodio proteolítico temprano en la cascada de activación 30 de contacto. Claramente, la inhibición específica de calicreína sería un enfoque muy atractivo para controlar la pérdida de sangre asociada con DCP y el inicio de respuesta inflamatoria sistémica (RIS) según se encontraría, por ejemplo, durante diversos procedimientos quirúrgicos invasivos. [0004] A pesar de ser el único compuesto con licencia para prevenir pérdida de sangre perioperatoria en DCP 35 para procedimientos de injerto de derivación de la arteria coronaria (IDAC), la aprotinina no se usa tan extensamente como se esperaría. Existen serias preocupaciones acerca del uso de este polipéptido bovino en pacientes que requieren DCP, y en particular el uso de este compuesto en procedimientos IDAC. La aprotinina no es específica para calicreína, pero interacciona con enzimas adicionales (por ejemplo, plasmina) en múltiples rutas. Así, el mecanismo de acción de aprotinina es altamente especulativo, y la ausencia de una comprensión precisa de lo que 40 resulta afectado durante el tratamiento con aprotinina produce el riesgo de complicaciones durante el tratamiento. Una complicación citada frecuentemente es trombosis no controlada, debida a las acciones de la aprotinina en la ruta fibrinolítica. Existe preocupación no sólo acerca de episodios hiperagudos como trombosis de los vasos mayores en el periodo perioperatorio, sino también sobre la permeabilidad del injerto después del procedimiento IDAC. Además, como una proteína de ocurrencia natural obtenida de pulmón bovino, la administración de aprotinina 45 en seres humanos puede desencadenar reacciones de hipersensibilidad o anafilácticas o anafilactoides graves después de la primera y, más a menudo, después de la administración repetida a los pacientes. Esto es especialmente preocupante en el gran número de pacientes que se someten a procedimientos IDAC repetidos. Además, existe una preocupación pública creciente sobre el uso de material obtenido de fuentes bovinas como vector potencial para la transmisión de encefalopatía espongiforme bovina a los seres humanos. [0005] Estas preocupaciones dejan claro que sigue existiendo la necesidad de medios y procedimientos más eficaces y más específicos para prevenir o reducir la pérdida de sangre perioperatoria y el inicio de RIS en un paciente sometido a cirugía que da como resultado la activación del SAC, como procedimientos IDAC en pacientes de DCP, o sustitución de cadera. RESUMEN DE LA INVENCIÓN   [0006] La presente descripción, que incluye la invención, se basa en el descubrimiento de péptidos que inhiben las serinproteasas. Las serinproteasas como, por ejemplo, la calicreína, están implicadas, por ejemplo, en rutas que conducen a pérdida excesiva de sangre perioperatoria y al inicio de respuesta inflamatoria sistémica. Entre los inhibidores de péptidos de calicreína preferidos se incluyen los descritos en las patentes de Estados Unidos nº 6.333.402 y 6.057.287 para Markland y col. La presente descripción se dirige en parte al uso de los péptidos en procedimientos y composiciones terapéuticos adecuados para su uso en la eliminación o reducción de diversas isquemias, incluyendo, pero sin limitarse a, pérdida de sangre perioperatoria, y el inicio de respuesta inflamatoria 2   sistémica. La pérdida de sangre perioperatoria procede de procedimientos quirúrgicos invasivos que conducen a la activación por contacto de componentes de complemento y a los sistemas de coagulación/fibrinólisis. Más específicamente, la presente descripción proporciona procedimientos para el uso de inhibidores de calicreína para reducir o prevenir la pérdida de sangre perioperatoria y una respuesta inflamatoria sistémica en pacientes sometidos a procedimientos quirúrgicos invasivos, especialmente cirugías cardiotorácicas. [0007] En un caso, la presente descripción se dirige a un procedimiento para prevenir o reducir isquemia en un paciente que comprende la administración al paciente de una composición que comprende un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos: Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Gly Xaa13 Cys Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Cys Xaa31 Xaa32 Phe Xaa34 Xaa35 Gly Gly Cys Xaa39 Xaa40 Xaa41 Xaa42 Xaa43 Xaa44 Xaa45 Xaa46 Xaa47 Xaa48 Xaa49 Xaa50 Cys Xaa52 Xaa53 Xaa54 Cys Xaa56 Xaa57 Xaa58 (SEQ ID NO: 1), en la que Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 o Xaa58 son cada uno individualmente un aminoácido o ausente; Xaa10 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: Asp y Glu; Xaa11 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: Asp, Gly, Ser, Val, Asn, Ile, Ala y Thr; Xaa13 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: Arg, His, Pro, Asn, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys y Gln; Xaa15 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: Arg, Lys, Ala, Ser, Gly, Met, Asn y Gln; Xaa16 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: Ala, Gly, Ser, Asp y Asn; Xaa17 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: Ala, Asn, Ser, Ile, Gly, Val, Gln y Thr; Xaa18 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: His, Leu, Gln y Ala; Xaa19 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: Pro, Gln, Leu, Asn y Ile; Xaa21 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: Trp, Phe, Tyr, His y Ile; Xaa22 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: Tyr y Phe; Xaa23 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: Tyr y Phe; Xaa31 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Ala, Val, Leu, Ile y Thr; Xaa32 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: Glu, Gln, Asp Asn, Pro, Thr, Leu, Ser, Ala, Gly y Val; Xaa34 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: Thr, Ile, Ser, Val, Ala, Asn, Gly y Leu; Xaa35 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: Tyr, Trp y Phe; Xaa39 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: Glu, Gly, Ala, Ser y Asp; Xaa40 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: Gly y Ala; Xaa43 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: Asn y Gly; Xaa45 es un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en: Phe y Tyr; y en la que el polipéptido inhibe calicreína. [0008] En un caso particular, la isquemia es pérdida de sangre perioperatoria debida a un procedimiento quirúrgico realizado en el paciente. El procedimiento quirúrgico puede ser una cirugía cardiotorácica, como, por ejemplo, injerto de derivación cardiopulmonar o derivación de la arteria coronaria. [0009] En un caso particular, las posiciones... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos: Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (aminoácidos 3-60 de la SEQ ID NO: 2), en el que el polipéptido inhibe la calicreína plasmática. 2. El polipéptido según la reivindicación 1, en el que el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos: Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (aminoácidos 3-60 de la SEQ ID NO: 2). 3. El polipéptido según la reivindicación 1, en el que el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos: Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 2). 4. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según la reivindicación 1 y uno o más tampones, vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables. 5. La composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos: Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (aminoácidos 3-60 de la SEQ ID NO: 2). 6. La composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos: Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp (SEQ ID NO: 2). 7. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que la composición es un polvo seco liofilizado. 8. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que la composición se formula para administración subcutánea. 9. Un recipiente que comprende la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8. 10. El recipiente según la reivindicación 9, en el que el recipiente es un frasco para infusión. 11. Una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 45 12. La molécula de ácidos nucleicos según la reivindicación 11, en la que dicha secuencia de ácidos nucleicos codifica el polipéptido según la reivindicación 3.   21   22   23   24