POLÍMEROS ENDOSOMOLÍTICOS.

El paradigma actual del desarrollo de vectores no víricos para la entrega de ADN, es presentar una unidad vírica y una transferencia de los genes mediante la incorporación, de manera combinatoria, de grupos funcionales que permiten una unidad particular y unas etapas para la transferencia. Los polímeros o los lípidos catiónicos se utilizan para condensar el ADN en pequeñas partículas similares a virus. Esta etapa de condensación se considera importante por varias razones: a) la protección del ADN frente a la inactivación a través de componentes de la sangre, b) la protección del ADN frente a la degradación con nucleasas extracelulares, c) la extravascularización de la partícula a través de pequeños orificios (fenestraciones) en la barrera endotelial (para las vías de administración intravasculares), y d) la endocitosis celular. Los grupos funcionales se incorporan en vectores sintéticos para mejorar la localización de dianas celulares, el escape endosómico y la localización de dianas nucleares del ADN, que se va a entregar. Estas señales incluyen ligandos en la superficie celular, diseñados para dirigir el vector hasta un tipo particular de célula y/o mejorar la captación endocítica de la partícula mediante adsorción o a través de un receptor. El vector también puede contener moléculas diseñadas para mejorar la liberación de la partícula de ADN fagocitada, dentro del citoplasma celular. Aunque los componentes de un vehículo de entrega de ADN se conocen en teoría, la creación de un vector de entrega eficaz no vírico ha sido difícil en la práctica. Los polímeros o los lípidos catiónicos, que son adecuados para la condensación del ADN, tienden a ser tóxicos o tienen una biodistribución escasa. Del mismo modo, los compuestos que pueden poseer una buena actividad de ruptura endosómica, también son con frecuencia tóxicos. Aunque los polímeros y los lípidos catiónicos son esenciales para condensar el ADN en nanopartículas, su naturaleza catiónica limita su utilidad más extensa para aplicaciones in vivo, no sólo por la baja expresión génica, sino también por la toxicidad. La ruta de administración intravascular, una vía atractiva para la entrega con amplia difusión, está particularmente afectada por la toxicidad, así como por problemas de biodistribución. Una disminución de la eficacia de la transfección in vivo, se debe en parte a la interacción de los poliplejos o lipoplejos (complejos de polí- mero-ADN y de liposoma-ADN) con componentes sanguíneos, tales como las proteínas séricas que inhiben la transfección. Este efecto se atribuye generalmente a la opsonización de los complejos de ADN mediante componentes del suero. Además, los complejos de ADN catiónicos inyectados por vía intravenosa también se tropiezan con tipos de células no deseadas, tales como macrófagos, monocitos, neutrófilos, plaquetas y eritrocitos, que son unos impor- tantes mediadores potenciales de la toxicidad. Las manifestaciones tóxicas de complejos de ADN catiónicos admi- nistrados de forma sistémica pueden variar desde una aglutinación de glóbulos rojos hasta una reacción inflamatoria fuerte y elevados niveles séricos de enzimas hepáticas. Varios estudios han tratado de evitar tales interacciones adversas, mediante la inclusión de polietilenglicol (PEG) o proteínas, tales como la albúmina o la transferrina, en los complejos de ADN. Otro método propuesto para disminuir la carga de una partícula de ADN condensada en un poli- catión y, por tanto, para reducir la interacción con los componentes del suero, es recargar el complejo ADN/policatión mediante la adición de un polianión. Complejos alternos de policationes y polianiones forman estructuras en capas cuando se absorben sobre macrosuperficies de soluciones acuosas. Se ha mostrado que un fenómeno similar tiene lugar en la superficie de partículas de ADN condensadas con policationes, cuando forman complejos adicionales con un polianión de tercera capa (documento de solicitud de patente de los EE.UU. nº de serie 09/328975, incorporado en esta memoria como referencia). El hígado es uno de los tejidos diana más importante para la terapia génica, dado su papel fundamental en el metabolismo (por ejemplo, metabolismo de las lipoproteínas en diversas hipercolesterolemias) y en la secreción de proteínas circulantes (por ejemplo, factores de coagulación en la hemofilia). Por lo menos se podrían corregir cien trastornos genéticos diferentes, al menos parcialmente, con una terapia génica dirigida hacia el hígado. Su frecuencia acumulada es de aproximadamente uno por ciento de todos los nacimientos. Además, los trastornos adquiridos, tales como la hepatitis crónica y la cirrosis son comunes y también se podrían tratar con terapias hepáticas basadas en polinucleótidos. Las terapias génicas que implican la expresión de genes heterotópicos, ampliaría adicionalmente el número de trastornos tratables mediante la transferencia génica dirigida hacia el hígado. Por ejemplo, la diabetes mellitus se podría tratar mediante la expresión del gen de la insulina en los hepatocitos, cuya fisiología puede permi- tir la secreción de insulina regulada con glucosa. La terapia génica abarca la entrega deliberada de material genético a las células con el fin de tratar una enfermedad, así como para el estudio o la investigación biomédica. La investigación se puede utilizar para estudiar la función génica o para facilitar el descubrimiento o la validación de fármacos. Aunque los vectores víricos son la base de la mayoría de los estudios preclínicos y de los ensayos clínicos en humanos, para la entrega de ADN a las células hepáticas, las vías no víricas siguen avanzando. Los poliplejos, los lipoplejos y los lipopoliplejos han sido todos propuestos como vectores de entrega en el hígado. La mayor parte de los estudios de transferencia no vírica en el hígado han utilizado poliplejos que normalmente contienen poli-L-lisina o PEI y ligandos para el receptor de la asialoglicoproteína (ASGPr). También se han descritos liposomas y lipopoliplejos para la transferencia génica en el hígado. Estamos orientados en desarrollar nanopartículas de ADN que sean mejores para salvar dos etapas decisivas: pasar a través del sistema circulatorio para acceder a los hepatocitos y liberar su carga genética desde los endosomas. Las partículas pueden contener ligandos para mejorar la localización de dianas en hepatocitos y la absorción. 2   Resumen de la invención En esta memoria se describen polímeros lábiles en función del pH, modificados de forma reversible, partículas para la entrega de polinucleótidos que contienen dichos polímeros y métodos para la generación de dichos polímeros y partículas. Las partículas descritas incorporan químicas endosomolíticas y nanotecnologías para ensamblar nanopartículas capaces de entregar polinucleótidos a las células desde la circulación periférica, con la subsiguiente liberación desde los endosomas. En una realización preferida, se describen compuestos y partículas que incorporan dichos compuestos para liberar moléculas desde un endosoma en el citoplasma de una célula. Los compuestos comprenden polímeros con actividad membranal inhibidos de forma reversible que se someten a eventos selectivos de escisión química en el medio ácido del endosoma. Antes de entrar en el endosoma, la actividad del polímero con actividad membranal se inhibe por la fijación covalente y reversible de un inhibidor. Tras la exposición a condiciones ácidas, tales como en un endosoma o en un lisosoma acidificado, el enlace que une el inhibidor con el polímero se rompe, desenmascarando la actividad membranal del polímero. En una realización preferida, se describen nanopartículas para la entrega de un polinucleótido a una célula. Las partículas comprenden un polianión asociado iónicamente con un complejo binario de polinucleótido/policatión. El policatión, el polianión, o ambos, consisten en un polímero con actividad membranal. Un policatión con actividad membranal se puede inhibir de forma reversible. El polianión puede ser una poliamina con actividad membranal, modificada de forma reversible. El polianión recarga el complejo para reducir la carga positiva del complejo binario o para aumentar la carga negativa de la nanopartícula. La nanopartícula puede estar cargada positivamente, cargada negativamente o cargada de forma neutra. La partícula puede contener una pluralidad de polinucleótidos, policationes o polianiones. Para incrementar la estabilidad de la partícula, se prefieren policationes y polianiones de peso molecular mayor que aproximadamente 10.000 Dalton. La estabilidad de las partículas se puede incrementar adicionalmente por el entrecruzamiento del polianión con el policatión. En una realización preferida, se describen métodos para la... [Seguir leyendo]

1.- Una nanopartícula para entregar un polinucleótido a una célula que comprende: dicho polinucleótido asociado con un polímero con actividad membranal inhibida de forma reversible, en donde dicho polímero con actividad membranal inhibida de forma reversible consiste en una pluralidad de inhibidores con actividad membranal, ligados de forma reversible a una poliamina con actividad membranal a través de un enlace lábil en función del pH, en don- de dichos inhibidores se seleccionan entre el grupo consistente en: derivados de anhídrido maleico disustituidos, y en donde la nanopartícula comprende adicionalmente un policatión. 2.- La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho polímero con actividad membranal inhibida de forma reversible está asociado con dicho polinucleótido a través de una interacción electroestática. 3.- La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho policatión es un polímero con actividad membranal. 4.- La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho policatión se selecciona entre PBAVE, PPAVE o PBAVE. 5.- La nanopartícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicho policatión está entrecruzado con dicha poliamina con actividad membranal inhibida de forma reversible, a través de un enlace lábil en función del pH. 6.- La nanopartícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dichos derivados de anhídrido maleico disustituidos se seleccionan entre los grupos consistentes en CDM, CDM-tioéster y CDM-PEG. 7.- La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la nanopartícula consiste en una nanopartícula estable frente a una sal. 8.- La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho polímero con actividad membranal tiene un peso molecular de al menos aproximadamente 10.000 Dalton. 9.- La nanopartícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dicho polímero con actividad membranal inhibida de forma reversible rompe una membrana endocítica, proporcionando de este modo la entrega de dicho polinucleótido en el citoplasma de la célula. 10.- Un método para la entrega in vitro de una nanopartícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el citoplasma de una célula que comprende: cultivar células de mamífero en un medio de cultivo adecuado, añadir dicha nanopartícula a dichas células cultivadas e incubar las células durante un periodo de tiempo adecuado. 11.- Uso para la entrega in vivo de una nanopartícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el citoplasma de una célula. 13   14     16