POLIMERASAS DE ADN TERMOESTABLES MODIFICADAS PARA SECUENCIACIÓN.

Polimerasas de ADN termoestables modificadas para secuenciación Ámbito de la presente invención La presente invención se refiere a polimerasas de ADN termoestables con mayor eficiencia para incorporar nucleósido trifosfatos marcados con colorantes de la familia de las fluoresceínas. La presente invención proporciona medios para aislar y producir este tipo de polimerasas modificadas. Los enzimas de la presente invención sirven para muchas aplicaciones en biología molecular. Antecedentes de la presente invención La incorporación de nucleósido trifosfatos (dNTPs) marcados con colorantes fluorescentes es importante para muchas aplicaciones de síntesis de ADN in vitro. Por ejemplo, las reacciones de secuenciación de ADN mediante terminador marcado con colorante requieren la incorporación de análogos de didesoxinucleótidos fluorescentes para la terminación y el marcado. Además la síntesis in vitro de productos marcados puede implicar la incorporación de nucleótidos o análogos de nucleótidos fluorescentes. Por ejemplo, se ha empleado ADN con marcador fluorescente en ensayos de hibridación, usando micromatrices de muestras inmovilizadas (Cronin y otros, 1996, Human Mutation 7:244). Para asegurar la fidelidad de la replicación de ADN, las polimerasas de ADN tienen una fuerte tendencia a la incorporación de sus substratos normales, denominados aquí desoxinucleótido trifosfatos (dNTPs) convencionales, y contra la incorporación de dNTPs no convencionales, incluyendo dNTPs y análogos de dNTPs marcados con colorantes fluorescentes. En la célula esta propiedad atenúa la incorporación de bases anormales como el dUTP a una cadena creciente de ADN. Esta característica es particularmente evidente in vitro, donde se encuentran ambos tipos de nucleósido trifosfato con marcador fluorescente, los convencionales y no convencionales, tal como en las reacciones de secuenciación de ADN con el uso de una versión del método didesoxi de terminación de la cadena mediante terminadores colorantes (Lee y otros, 1992, Nuc. Acids. Res. 20:2471, la cual se incorpora aquí como referencia). Los kits de secuenciación cíclica de ADN disponibles en el comercio para los métodos de terminación con colorante llevan como terminadores de cadena ddNTPs marcados con colorantes fluorescentes de la familia de la rodamina. Sin embargo los colorantes de rodamina son de carga zwitteriónica y los nucleósido trifosfatos marcados con estos colorantes migran anormalmente en los geles electroforéticos usados para separar los productos de secuenciación a detectar. Esta propiedad de la familia de los colorantes de rodamina obliga a modificar el protocolo de secuenciación estándar, incluyendo el uso de dITP y una etapa de proceso adicional antes de la electroforesis. En cambio los colorantes de carga negativa, como los de la familia de la fluoresceína, permiten 1) mejor separación entre los nucleósido trifosfatos marcados y los productos de extensión del cebador marcado, y 2) mejor migración electroforética de los productos de secuenciación marcados, en comparación con los colorantes de carga neutra o positiva. Por tanto el uso de colorantes de la familia de la fluoresceína evita la necesidad de las etapas adicionales de proceso que requiere el uso de colorantes de la familia de la rodamina. Sin embargo los colorantes disponibles de la familia de la fluoresceína no son ideales para los formatos comerciales de secuenciación cíclica de ADN usuales, porque al emplear estos formatos los ddNTPs marcados con estos colorantes no se incorporan eficientemente a los productos de secuenciación. Por consiguiente se necesitan polimerasas de ADN termoestables, comercialmente disponibles, capaces de incorporar eficientemente tanto nucleótidos convencionales como nucleótidos marcados con fluoresceína. La presente invención sirve para satisfacer esta necesidad. Además, una propiedad inesperada de los enzimas mutantes de la presente invención es la mayor tasa de extensión del cebador respecto al correspondiente enzima natural. Otra propiedad inesperada es una incorporación más uniforme de varios nucleótidos terminadores en el análisis automatizado de la secuencia de ADN. Resumen de la presente invención La presente invención proporciona enzimas termoestables de polimerasa de ADN dependientes de molde con menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con los enzimas caracterizados anteriormente. Estos enzimas incorporan nucleótidos, incluyendo desoxinucleótidos (dNTPs) y análogos de bases como los didesoxinucleótidos (ddNTPs), que están marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína de manera más eficiente que los enzimas termoestables convencionales. Por la presente invención, en las polimerasas de ADN termoestables se identifica una región crítica que afecta a la capacidad de la polimerasa para incorporar nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, pero manteniendo la capacidad de incorporar fielmente nucleótidos naturales. Así, en un aspecto, la presente invención proporciona enzimas recombinantes termoestables de polimerasa de ADN, que se caracterizan por haber sido mutados para producir el motivo crítico y tener menor discriminación contra la 2 E98116786 02-01-2012   incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con los correspondientes enzimas de tipo natural. Se describen enzimas recombinantes termoestables de polimerasa de ADN caracterizados porque a) en su forma nativa dicha polimerasa comprende la secuencia aminoácida (indicada en código de una letra) LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 1), donde X es un aminoácido cualquiera; b) la X en la posición 4 de dicha secuencia está mutada en comparación con dicha secuencia nativa, pero no a E; y c) dicha polimerasa termoestable de ADN tiene una menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con la forma nativa de dicho enzima. En el código de tres letras esta secuencia de aminoácidos está representada por LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEQ ID NO: 1), donde Xaa en las posiciones 3, 4, 6, 9 y 10 de esta secuencia es cualquier resto de aminoácido y Xaa en la posición 7 de esta secuencia es Val o Ile. En una forma de ejecución las polimerasas recombinantes termoestables de ADN se caracterizan porque a) la forma nativa de la polimerasa comprende la secuencia aminoácida LSQXL(S/A)IPYEE (SEQ ID NO: 2), donde la X en la posición 4 de dicha secuencia está mutada a K; y c) dicha polimerasa termoestable de ADN tiene una menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con la forma nativa de dicho enzima. En el código de tres letras esta secuencia de aminoácidos está representada por LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu (SEQ ID NO: 2), donde Xaa en la posición 3 es Gln, Xaa en la posición 4 es Lys y Xaa en la posición 6 es Ser o Ala. En una forma de ejecución preferida la secuencia de aminoácidos es LSQXLAIPYEE (SEQ ID NO:3), donde es Lys. En el código de tres letras esta secuencia aminoácida está representada por LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO:3), donde Xaa en la posición 4 es Lys. Además se describen polimerasas recombinantes termoestables de ADN caracterizadas porque a) la forma nativa de la polimerasa comprende la secuencia aminoácida LSVXLG(V/I)PVKE (SEQ ID NO: 4); b) la X en la posición 4 de dicha secuencia está mutada en comparación con dicha secuencia nativa, pero no a E; y c) dicha polimerasa termoestable de ADN tiene una menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con la forma nativa de dicho enzima. En el código de tres letras esta secuencia de aminoácidos está representada por LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu (SEQ ID NO: 4), donde Xaa en la posición 4 es un aminoácido cualquiera y Xaa en la posición 7 es Val o Ile. Asimismo la secuencia aminoácida es LSVXLGVPVKE (SEQ ID NO: 5), donde la X en posición 4 es un aminoácido cualquiera. En el código de tres letras esta secuencia aminoácida está representada por LeuSerVaIXaaLeuGlyValProValLysGlu (SEQ ID NO: 5), donde Xaa en la posición 4 es un aminoácido cualquiera o Arg. Además la secuencia aminoácida es LSVXLGIPVKE (SEQ ID NO: 6), donde la X en la posición 4 es un aminoácido cualquiera. En el código de tres letras esta secuencia de aminoácidos está representada por LeuSerValXaaLeuGlyIleProvalLysGlu (SEQ ID NO: 6), donde Xaa en la posición 4 es un aminoácido cualquiera o Arg. En otro aspecto se describe que la región crítica particular de la presente invención se puede combinar con motivos de otras...

1. Método para producir ADN marcado, que consiste en: i) proporcionar una ADN polimerasa recombinante termoestable, derivada de Thermus aquaticus, caracterizada porque a) en su forma nativa dicha polimerasa lleva la secuencia aminoácida LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEQ ID NO: 1), donde Xaa en la posición 3 es Gln, Xaa en la posición 9 es Tyr, Xaa en la posición 10 es Glu y Xaa en la posición 7 de dicha secuencia es Ile; b) dicho Xaa en la posición 4 está mutado a Lys, en comparación con dicha secuencia nativa; c) dicho Xaa en la posición 6 es Ser o Ala; d) dicha ADN polimerasa termoestable contiene las mutaciones G46D y F667Y; y e) dicha ADN polimerasa termoestable tiene un menor nivel de discriminación contra la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con la forma nativa de dicha polimerasa, siendo dicho nucleótido un didesoxinucleótido y siendo dicho nivel de discriminación al menos 3 veces inferior al de dicha forma nativa de dicha polimerasa, y dicho nivel de discriminación se mide calculando la concentración de didesoxinucleótido, marcado con un colorante de fluoresceína, que es necesaria para inhibir la síntesis de ADN en un 50%; ii) proporcionar un nucleótido marcado con un colorante fluorescente cargado negativamente o con un colorante de cianina; y iii) efectuar una reacción de síntesis de ADN. 2. El método de la reivindicación 1, en que dicha ADN polimerasa recombinante termoestable se caracteriza porque a) en su forma nativa dicha polimerasa lleva la secuencia aminoácida LeuSerGlnXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu (SEQ ID NO:3), b) dicho Xaa en la posición 4 está mutado a Lys, y c) dicha ADN polimerasa termoestable tiene un menor nivel de discriminación contra la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con la forma nativa de dicha polimerasa, y dicho nucleótido está marcado con un colorante de cianina. 3. El método de la reivindicación 1 o 2, en que la reacción de síntesis de ADN es una PCR, una amplificación por desplazamiento de hebra, una amplificación mediada por transcripción, una extensión del cebador o una reacción de transcripción inversa. 23 E98116786 02-01-2012   Taq ADN Polimerasa 24 E98116786 02-01-2012