POBLACIÓN DE CÉLULAS MADRE OBTENIDAS DE RIÑÓN, IDENTIFICACIÓN Y USO TERAPÉUTICO.

Población de células madre obtenidas de riñón, identificación y uso terapéutico Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere al campo de células madre y su uso. Estado de la técnica [0002] Se conoce bien que muchos órganos adultos contienen células madre pluripotenciales implicadas en el mantenimiento de integridad de tejido y en procesos de reparación. [0003] La disponibilidad de células madre de riñón capaces de regenerar tejido renal después del daño es muy importante para la perspectiva de prevención y terapia de cualquier tipo de daño renal. De hecho, las enfermedades de riñón agudas y crónicas representan una emergencia de salud pública debido a su pertinencia epidemiológica y a sus elevados costes implicados en tratamientos sustitutivos, tales como diálisis y trasplante. Sumario de la invención [0004] La invención hace disponibles células madre de riñón capaces de co-expresar marcadores CD 133 y CD 24 en su superficie Breve descripción de las figuras [0005] La Figura 1 muestra la co-expresión de marcadores de células madre CD24 y CD133 e identifica una subpoblación celular en la cápsula de Bowman de riñones adultos humanos. La Figura 2 se refiere al aislamiento y caracterización de células CD24+ CD133+. La Figura 3 muestra la capacidad proliferativa de células CD24+ CD133+ en comparación con células CD24- CD133-. La Figura 4 muestra la diferenciación de clones obtenidos a partir de células CD24+ CD133+ obtenidas a partir de la cápsula de Bowman con células epiteliales tubulares. La Figura 5 muestra la diferenciación de clones obtenidos a partir de células CD24+ CD133+ obtenidas a partir de la cápsula de Bowman con osteoblastos y adipocitos. La Figura 6 muestra la adquisición de propiedades fenotípicas funcionales neuronales por clones obtenidos a partir de células CD24+ CD133+ obtenidas a partir de la cápsula de Bowman. La Figura 7 muestra células CD24+ CD133+ de riñón humano implantadas en riñones de ratones SCID que sufren de insuficiencia renal aguda (ARF) y la generación de diferentes tipos de células tubulares. La Figura 8 muestra que las células CD24+ CD133+ protegen a ratones tratados con glicerol del deterioro de estructura y función de riñón. Descripción detallada de la invención [0006] La presente invención permiten superar el problema mencionado anteriormente haciendo disponibles células madre de riñón pluripotenciales. [0007] De hecho, se ha observado de forma sorprendente que las células renales capaces de co-expresar los marcadores CD133 y CD24 (CD24+ CD133+) en su superficie poseen capacidad de célula madre. Identificación y aislamiento de células madre de riñón [0008] Veinte riñones humanos normales se han examinado mediante microscopía confocal usando anticuerpos monoclonales anti-CD24 y anti-CD133. CD24, un marcador de la población de células progenitoras embrionarias de riñón, se observó que se expresaba selectivamente en células del epitelio parietal en la cápsula de Bowman y en una subpoblación de células epiteliales tubulares. El anticuerpo monoclonal anti-CD133, que identifica selectivamente células madre obtenidas a partir de diversos tejidos humanos, detectó una subpoblación de células de la cápsula de Bowman y estructuras tubulares raras (Fig. 1). La inmunofluorescencia doble para CD24 y CD133 mostró que los dos marcadores identifican una subpoblación de células de la cápsula de Bowman que se localizan mayormente a nivel del polo urinario del glomérulo y con frecuencia se extienden a la parte del túbulo más cerca al polo urinario (Fig. 1). Las mismas células también se marcaron con anticuerpo monoclonal anti-CD106. En conjunto, estos resultados sugieren la existencia, en el riñón humano adulto, de una población de células a nivel del epitelio de la cápsula de Bowman y una población rara de células tubulares, en la que se co-expresan los diferentes marcadores de células madre, como se muestra en la Figura 1, cuyas diversas imágenes se describen en lo sucesivo en el presente documento con detalle: 2 E07728587 01-12-2011   a) Tinción de inmunofluorescencia doble, que muestra expresión de CD24 (rojo) y CD133 (verde) en células de la cápsula de Bowman a partir de un riñón de un sujeto adulto humano. La superposición de los dos patrones de tinción (amarillo) muestra co-expresión de CD24 y CD133 en una subpoblación de células localizadas en el polo urinario (PU, Bar 50 m). To-pro-3 tiñe por contraste los núcleos (azul). b) Tinción de inmunofluorescencia doble, detectada a aumento más elevado, que muestra la expresión de CD24 (rojo) y CD133 (verde) en células de la cápsula de Bowman. La superposición de los dos patrones de tinción muestra co-localización de CD24 y CD133 en el citoplasma y en la membrana de células frente al glomérulo (G) mientras que únicamente CD24 se expresa en la membrana basal (amarillo, Bar 10 m). Topro-3 tiñe por contraste los núcleos (azul). c) Detección de CD133 con dos anticuerpos monoclonales anti-CD133 diferentes. Anticuerpo 293C3 (rojo) y anticuerpo AC133 (verde) tiñen la misma subpoblación de células en la cápsula de Bowman. La imagen superpuesta, que muestra ambos patrones de tinción, muestra co-tinción de las mismas células (amarillo, Bar 50 m). To-pro-3 tiñe por contraste los núcleos (azul). d) Detección de CD24 (rojo), CD133 (verde) y CD29 (azul) a nivel de los glomérulos. La tinción de CD29 permite la identificación de la arteriola aferente (AA). La imagen superpuesta muestra que CD24 y CD133 se co-expresan de forma selectiva en una subpoblación de células localizadas en el lado opuesto del polo vascular (amarillo, Bar 50 m). e) Tinción de inmunofluorescencia triple, detectada a aumento más elevado, que muestra expresión de CD24 (rojo), CD133 (verde) y CD106 (azul) en células de la cápsula. La imagen superpuesta muestra la co- localización de CD24 y CD133 (amarillo) en el citoplasma y en la membrana de las células frente al glomérulo (G), mientras que CD24 y CD106 (color púrpura) se co-expresan en la membrana basal. Las áreas visibles de co-expresión de CD24, CD133 y CD106 están teñidas en blanco (Bar 10 m). [0009] Después las células CD24+ CD133+ se aislaron con el fin de evaluar sus características morfológicas y funcionales. Para este propósito, el componente cortical del tejido renal se separó del componente medular y se sometió a trituración. Los glomérulos se aislaron mediante una técnica de separación convencional usando tamices de diferente porosidad. Para evitar la destrucción de las células CD24+ CD133+ de la cápsula de Bowman, la suspensión glomerular no se digirió sino que se cultivó directamente en placas de plástico que contenían EGM - MV (Lonza Group, Walkersville, EE.UU.) complementado con FBS al 20%. Las células que salían de los glomérulos cultivados se examinaron para determinar su capacidad de formar agregados celulares parecidos a neuroesferas y su fenotipo de célula madre se evaluó mediante microscopía confocal y análisis citofluorométrico como se muestra en la Figura 2, las diversas imágenes de las cuales se describen a continuación con detalle: a) El primer panel de la izquierda muestra células en proliferación que salen de un glomérulo encapsulado en cultivo (40x). Imágenes posteriores obtenidas mediante microscopía confocal láser muestran que la población en proliferación expresa CD24 (verde). To-pro-3 tiñe por contraste los núcleos (azul). La imagen superpuesta muestra que las células en proliferación expresan cantidades notables de CD24 (Bar 100 m). a) Tinción de inmunofluorescencia doble que detecta la expresión de CD24 (rojo) y CD133 (verde), que muestra co-localización selectiva de los dos marcadores en la población obtenida a partir de células glomerulares en proliferación. To-pro-3 tiñe por contraste los núcleos (azul). La imagen superpuesta muestra tinción de CD24 y CD133 intensa en las mismas células (amarillo, Bar 100 m). c) El cultivo primario de células de la cápsula de Bowman representa una población homogénea que comprende aproximadamente el 100% de células que expresan CD24, CD133, CD106, CD105 y CD44 y da un resultado negativo para marcadores de células endoteliales CD31 y CD34. También se muestra un análisis mediante citometría de flujo de un cultivo representativo. d) Un cultivo primario a partir de células de la cápsula de Bowman CD24+ CD133+ no expresa marcadores de linaje de riñón, tales como CD35 o EMA-1, como se muestra mediante citometría de flujo en los primeros dos paneles. Se muestra, mediante microscopía confocal, que las mismas células no expresan THG (tercer panel) ni LTA (cuarto panel) (Bar 100 m). Tinción histoquímica negativa para fosfatasa alcalina (último panel). Se muestra un cultivo representativo. e) Medición de niveles de ARNm Oct-4 mediante RT-PCR cuantitativa... [Seguir leyendo]

1. Células madre de riñón caracterizadas por que las mismas co-expresan CD133 y CD24. 2. Células de riñón de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizadas por que las mismas se originan a partir de la cápsula de Bowman. 3. Composición que comprende células madre de riñón de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2. 4. Proceso para aislamiento de células madre renales de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, en el que: - los glomérulos renales se aislaron mediante una técnica de separación convencional que emplea tamices con permeabilidad diferente; - la suspensión glomerular obtenida de este modo se cultivó directamente en placas plásticas que contenían EGM-MV complementado con FBS al 20%; - se aislaron las células que salen de los glomérulos en cultivo y expresan marcadores CD133 y CD24. 5. Proceso para el aislamiento de células de acuerdo con las reivindicaciones 1-2 mediante separación inmunomagnética a partir de tejido de riñón completo digerido con colagenasa, usando marcadores CD133 y CD24. 6. Uso de población de células madre de acuerdo con la reivindicación 1-2 para la preparación de una composición para reparación de daño de riñón. 8 E07728587 01-12-2011   9 E07728587 01-12-2011   E07728587 01-12-2011   11 E07728587 01-12-2011   12 E07728587 01-12-2011   13 E07728587 01-12-2011   14 E07728587 01-12-2011   E07728587 01-12-2011   16 E07728587 01-12-2011