Nuevo polipéptido que tiene una actividad de esterasa, y esterasa recombinante y su uso.

Un polipéptido o una proteína recombinante que exhibe una identidad de al menos 98 % con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No:

1 y que tiene una actividad para la resolución de racematos de ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos de la fórmula (I) .

en la que R es un radical alquilo de C1-C6, R1 es alquilo de C1-C4, y X es cloro, bromo o yodo.

Nuevo polipéptido que tiene una actividad de esterasa, y esterasa recombinante y su uso El invento se refiere a un nuevo polipéptido que tiene una actividad de esterasa, que tiene especialmente una actividad de 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxil-esterasa, y a una proteína recombinante activa enzimáticamente, que tiene una actividad de esterasa, y a su uso para resolver racematos de mezclas de enantiómeros de ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílicos.

Los ácidos 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílicos y sus ésteres, enriquecidos en cuanto a enantiómeros, son valiosos compuestos intermedios para preparar productos farmacéuticos, tales como, por ejemplo, delta-aminogamma-hidroxi-omega-arilalcanocarboxamidas, que tienen propiedades inhibidoras de la renina y se pueden utilizar como agentes antihipertensivos en formulaciones farmacéuticas.

Las esterasas se emplean generalmente en la resolución de racematos y la asimetrización. Sin embargo, solo están disponibles comercialmente muy pocas esterasas apropiadas para preparar compuestos quirales. El uso de extractos de extractos de esterasas procedentes de los hígados de cerdos es conocido a la escala preparativa. Una esterasa de hígado de cerdo (PLE) fue aislada hace mucho tiempo a partir de fuentes naturales, y su actividad ha sido conocida también ya durante un largo tiempo (Simonds, J. P. (1919) Amer. J. Physiol. 48, 141; Bamann, E. y colaboradores (1934) Hoppe-Seyler Z. 229, 15; Falconer J. S. y Taylor, D. B. (1946) Biochem. J. 40, 831-834) .

Ya se han llevado a cabo diversos estudios con el fin de caracterizar a una PLE (Heymann, E. y Junge, W. (1979) Eur. J. Biochem. 95, 509-518; Lehner, R. y Verger, T. (1997) Biochemistr y 36, 1861-1868) . Ha sido posible además mostrar, por ejemplo en el documento de solicitud de patente internacional WO 01/09079, que unos extractos de esterasas procedentes de los hígados de cerdos pueden hidrolizar selectivamente al enantiómero (R) del 5-cloro-2- (1-metiletil) -4-pentenoato de metilo. Sin embargo, el uso de dichos extractos de esterasas procedentes de fuentes naturales, tales como el hígado de un cerdo, está asociado con desventajas. En primer lugar, las calidades de las diferentes tandas varían y por lo tanto hacen difícil optimizar los procesos industriales. En segundo lugar, el uso de recursos animales en la producción de productos farmacéuticos es indeseado, puesto que no siempre se puede excluir la presencia de virus y priones. Por estas razones existe una necesidad de producir esterasas recombinantes de hígados de cerdo de calidad normalizada en microorganismos. La clonación de putativos genes de esterasas se describe por ejemplo en FEBS Lett. (1991) , 293, 37-41. La primera expresión funcional de una enzima esterasa activa procedente del hígado de un cerdo fue descrita por primera vez en el documento WO 02/48322. El documento WO 2004/055177 describe la preparación de otras esterasas recombinantes mediante una mutagénesis dirigida a un sitio de la esterasa recombinante de hígado de un cerdo con la SEQ. ID No. 1 (rPLE) procedente del documento WO 02/48322. Como resulta evidente a partir de la descripción del documento WO 2004/055177 y a partir del artículo que tiene como autores los mismos inventores en Protein Engineering, 16, 11391145, 2003, se escogieron las modificaciones de la secuencia de rPLE procedente del documento WO 02/48322, de manera tal que se obtenga una esterasa intestinal recombinante de cerdo (PICE) , descrita en la cita de David y colaboradores, (1998) Eur. J. Biochem. 257, 142-148. La resolución de ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos racémicos no se describe en ninguno de estos artículos.

Sin embargo, puesto que no ha satisfecho la necesidad de esterasas que tengan la deseada actividad estereoselectiva para ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílicos y que se puedan preparar con facilidad por vía biotecnológica, un objeto del presente invento fue el de proporcionar una correspondiente nueva esterasa recombinante.

En un intento de aislar y clonar el gen que se describió en FEBS Lett. (1991) , 293, 37-41 y en el documento WO 02/48322 para una conocida esterasa de hígado de cerdo (PLE, acrónimo de Pig Liver Esterase) como un ADNc (ácido desoxirribonucleico cromosomal) a partir de un ARNm (ácido ribonucleico mensajero) procedente del hígado de un cerdo, se encontró una segunda y nueva secuencia de esterasa, además de la conocida secuencia de PLE. A continuación de la expresión de las dos secuencias, en que se prepararon las correspondientes proteínas o esterasas, a saber la conocida rPLE y una nueva esterasa "alternativa" recombinante (rAPLE) , surgió inesperadamente el conocimiento de que solamente la rAPLE es capaz de efectuar una resolución selectiva de ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos racémicos.

Se hizo posible, por lo tanto, alcanzar el objetivo del presente invento mediante un nuevo polipéptido que tiene una actividad de esterasa, y una nueva esterasa recombinante (rAPLE) , cuya secuencia de aminoácidos difiere en 21 de un total de 548 aminoácidos con respecto de la conocida secuencia de PLE.

La nueva rAPLE difiere en la secuencia de aminoácidos también con respecto de la conocida carboxil-esterasa intestinal de cerdo (PICE, acrónimo de Pig Intestinal CarboxylEsterase) en 12 de un total de 548 aminoácidos. Sin embargo, la PICE es encontrada en el tracto intestinal de un cerdo.

El presente invento, correspondientemente, se refiere a un polipéptido que tiene una actividad de esterasa, que exhibe una identidad de por lo menos un 98 % con la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No. 1, y tiene una actividad para la resolución de los racematos de ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílicos de la fórmula (I) .

El presente invento se refiere además a una nueva proteína recombinante que tiene una actividad de esterasa, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No. 1, y que tiene una actividad para la resolución de racematos de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílicos de la fórmula (I) .

El polipéptido y la rAPLE recombinante del invento tienen la capacidad de resolver de manera estereoselectiva ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílicos racémicos de la fórmula (I) .

en la que R es un radical alquilo de C1-C6, R1 es alquilo de C1-C4, y X es cloro, bromo o yodo.

El polipéptido del invento que tiene una actividad de esterasa, y la nueva esterasa recombinante rAPLE difieren, tal como más arriba se ha señalado, en 21 de un total de 548 aminoácidos con respecto de la secuencia conocida que se describe en FEBS Lett. (1991) , 293, 37-41 y en 12 de un total de 548 aminoácidos con respecto de la conocida proteína PICE descrita en David y colaboradores (1998) Eur. J. Biochem. 257, 142-148.

La secuencia proteínica de la nueva rAPLE del invento difiere en las siguientes posiciones de aminoácidos con respecto de la conocida secuencia de la proteína PLE.

APLE Posición PLE

Glu 73 Asp

Ile 75 VaI

Gly 76 VaI

Gly 77 GIu Leu 80 Thr Arg 87 GIy Ile 92 Thr Pro 93 Leu Val 129 Leu Ser 133 Pro Thr 134 Met

Leu 138 Val Ala 139 Val Phe 234 Leu Ala 236 VaI

Gly 237 Ala Phe 286 Leu Ala 287 Thr Leu 290 Phe Pro 294 Gln Thr 302 Pro La proteína del invento y la nueva rAPLE recombinante pueden además estar en la forma de una secuencia modificada como se muestra en SEQ ID No 1, que se puede obtener por ejemplo por modificaciones usuales, tales como, por ejemplo, intercambio, supresión (= deleción) o adición de aminoácidos en la secuencia en el extremo terminal de N o C, tal como por ejemplo, GluAlaGluAla procedente de la secuencia de señal del factor α, o por fusión con otras proteínas. El invento incluye además unas muteínas que tienen modificaciones dentro de la secuencia proteínica de la enzima del invento que tiene la actividad apropiada, en particular sobre ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos. Las muteínas se pueden obtener, por ejemplo, por modificaciones del ADN que codifica la enzima del

invento, por conocidas técnicas de mutagénesis (mutagénesis aleatoria, mutagénesis dirigida a un sitio, evolución dirigida, transposiciones genéticas, etc.) de manera tal que el ADN codifica una enzima que difiere en por lo menos un aminoácido con respecto de la enzima del invento, y por subsiguiente expresión del ADN modificado en una célula anfitriona apropiada. El invento... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido o una proteína recombinante que exhibe una identidad de al menos 98 % con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No:1 y que tiene una actividad para la resolución de racematos de ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos de la fórmula (I) .

en la que R es un radical alquilo de C1-C6, R1 es alquilo de C1-C4, y X es cloro, bromo o yodo.

2. Un polipéptido o una proteína recombinante que tiene una actividad de esterasa de acuerdo con la reivindicación 1, que exhibe una secuencia de aminoácidos que ha sido modificada por una modificación seleccionada entre el 10 conjunto que consiste en mutación, supresión, inserción, prolongación y fusión.

3. Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido o una proteína recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-2.

4. Una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID No. 2.

5. Una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4 obtenible aislando un ARNm a partir de un hígado de cerdo, usando un estuche apropiado, luego generando un ADNc por transcripción inversa basándose en el extracto de ARNm, seguido por una amplificación de un fragmento de ácido nucleico usando un primer cebador que comprende la secuencia de nucleótidos GGGCAGCCAGCCTCGC y un segundo cebador que comprende la secuencia de nucleótidos GGGCAGCCAGCCTCGC.

6. El uso de un polipéptido o de una proteína recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para la resolución de racematos de ésteres de ácidos 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos de la fórmula (I) .

en la que R es un radical alquilo de C1-C6, R1 es alquilo de C1-C4, y X es cloro, bromo o yodo.

7. Un método para preparar ácidos 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílicos o ésteres de los mismos, enriquecidos en cuanto a enantiómeros de la fórmula (II)

en la que R es un radical alquilo de C1-C6, A es igual a H, R1, en que R1 puede ser alquilo de C1-C4, o R2, en que R2 es un grupo alquilo, pero no es igual a R1, y X es cloro, bromo o yodo, que comprende el recurso de que una mezcla de enantiómeros o un éster de un ácido 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílico de la fórmula (I)

en la que R, R1 y X son como se han definido más arriba, se convierte por medio de un polipéptido o de una esterasa recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en la presencia de agua o de un alcohol de la fórmula R2OH, en la que R2 es un grupo alquilo que no es igual a R1 como agente nucleófilo, y a) o bien se aísla el remanente éster de un ácido 2-alquil-5-halopent-4-enocarboxílico enriquecido en cuanto a enantiómeros de la fórmula (II) , en la que A es igual a R1, o b) si se emplea un alcohol como agente nucleófilo, se aísla el resultante éster de un ácido 2-alquil-5-halopent4-eno-carboxílico enriquecido en cuanto a enantiómeros de la fórmula (II) , en la que A es igual a R2, o 10 c) si se emplea agua como agente nucleófilo, se aísla el resultante ácido 2-alquil-5-halopent-4-eno-carboxílico de la fórmula (II) , en la que A es igual a H.

Figura 1: Actividad de esterasa estereoselectiva sobre el 5-cloro-2- (1-metiletil) -4-pentenoato de metilo A: Actividad sobre el substrato racémico: Transformantes de P. pastoris X-33

B: Actividad sobre el substrato racémico frente al enantiómero (S) Figura 2: SDS - PAGE de APLE recombinante 1: Escalera de Proteínas Page Ruler® (de Fermentas)

2: PLE disponible comercialmente 3: P. pastoris X-33 con pGAPZ A integrado (cepa testigo)

4: P. pastoris X-33 con pGAPZ A APLE-ER integrado Figura 3: Expresión inducida de esterasas de hígados de cerdo con el promotor AOX1

1: P. pastoris KM71 con pPIC9 APLE-ER integrado 2: P. pastoris KM71 con pPIC9 APLE-ER integrado 3: P. pastoris KM71 con pPIC9 APLE-ER integrado 4: P. pastoris KM71 con pPIC9 APLE+ER integrado 5: P. pastoris KM71 con pPIC9 APLE+ER integrado 6: P. pastoris KM71 con pPIC9 PLE-ER integrado 7: P. pastoris KM71 con pPIC9 PLE+ER integrado 8: P. pastoris KM71

9: PLE disponible comercialmente SEQ ID No 1 : Secuencia de proteínas de rAPLE

SEQ ID No 2 : Secuencia de nucleótidos de rAPLE

SEQ ID No 3 : Cebador 1

SEQ ID No 4 : Cebador 2

SEQ ID No 5 : EcoRIalfa1

SEQ ID No 6 : alfaPLE2

SEQ ID No 7 : PLEalfa1

SEQ ID No 8 : EcoRIPLE+ER2

SEQ ID No 9 : EcoRIPLE2