Nuevo grupo de alfa-amilasas, así como un procedimiento para la identificación y la obtención de nuevas alfaamilasas.

Proteína amilolítica cuya secuencia de aminoácidos contiene una porción que es idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO.

208 en un 95%, preferentemente en un 97,5% y muy preferentemente en un 00%.

Nuevo grupo de alfa-amilasas, así como un procedimiento para la identificación y la obtención de nuevas alfaamilasas La presente invención se refiere a un nuevo grupo de a-amilasas que pertenecen a un espacio de secuencias común, así como a proteínas suficientemente similares a estas a-amilasas con función amilolítica, a procedimientos para su obtención, así como a diversas posibilidades de aplicación de estas proteínas, especialmente en agentes de lavado y limpieza.

Las a-amilasas (E.C. 3.2.1.1) se hidrolizan en los enlaces a-1, 4-glicosídicos, situados en el interior del polímero, de los almidones y de los polímeros similares a los almidones tales como, por ejemplo, amilosa, amilopectina oglicógeno, con formación de dextrinas y de oligosacáridos º-1, 6-ramificados. Éstos pertenecen a las enzimas más importantes, que son utilizadas en la industria. Esto se debe a dos motivos: por un lado, son liberadas en su mayoría al medio circundante, igual que muchas enzimas o microorganismos degradantes del substrato, de tal manera que pueden ser obtenidas a escala industrial mediante fermentación y enriquecimiento del medio de cultivo con un coste proporcionalmente reducido. Por otro lado, se requieren amilasas para un gran espectro de aplicaciones.

El primer lugar de las aplicaciones técnicas de la a-amilasa lo ocupa la producción de jarabe de glucosa. Otras aplicaciones son, por ejemplo, las de componentes activos en agentes de lavado y limpieza, para el tratamiento de materias primas en la fabricación de productos textiles, la fabricación de pegamentos o la fabricación de alimentos o ingredientes alimentarios azucarados.

Un ejemplo para una amilasa empleada muy intensamente en el ámbito técnico es, por ejemplo, la a-amilasa procedente de Bacillus licheniformis comercializada por la firma Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca, con el nombre comercial Termamyl®. La amilasa que se obtiene a partir de B. subtilis o B. amyloliquefaciens, respectivamente, y que se ha dado a conocer por la solicitud de patente estadounidense US 1 227 374 es comercializada por la misma empresa con el nombre BAN®.

Esta molécula de amilasa o sus parientes próximos, respectivamente, han sido desarrollados en múltiples invenciones cuyo objetivo era optimizar sus propiedades enzimáticas para aplicaciones específicas con la ayuda de diversas modificaciones a nivel de la biología molecular. Estas optimizaciones pueden referirse, por ejemplo, a las especificidades de substrato, a la estabilidad de la enzima en diversas condiciones de reacción o a la misma actividad enzimática. Como ejemplo para estas optimizaciones se citan las siguientes solicitudes de patente: EP 0410498 para el encolado de tejidos y WO 96/02633 para la licuación de almidón.

Puesto que los desarrollos que consisten simplemente en optimizaciones de unas pocas enzimas de partida conocidas están limitados posiblemente en los resultados alcanzables, tiene lugar paralelamente una búsqueda intensiva de enzimas comparables a partir de otras fuentes naturales. Se han identificado enzimas que desintegran el almidón, por ejemplo, a partir de Pimelobacter, Pseudomonas y Thermus para la producción de alimentos, productos cosméticos y fármacos (EP 0 636 693) , otras a partir de Rhizobium, Arthrobacter, Brevibacterium y Micrococcus (EP 0 628 630) , a partir de Pyrococcus (WO 94/19454) y Sulfolobus para la licuación del almidón a altas temperaturas o bien en condiciones de reacción muy ácidas (EP 0 727 485 y WO 96/02633) . Se han encontrado amilasas a partir de Bacillus sp. para su aplicación en valores de pH alcalinos (WO 95/26397 y WO 97/00324) . Debido a su poca sensibilidad frente a los detergentes, otras amilasas procedentes de diferentes Bacilli (EP 0 670 367) son adecuadas para su utilización en agentes de lavado o limpieza.

Otras optimizaciones de las enzimas aisladas de fuentes naturales para el correspondiente campo de aplicación pueden realizarse, por ejemplo, mediante métodos de biología molecular (por ejemplo, según US 5171673 o WO 99/20768) o a través de modificaciones químicas (DE 4013142) . En la solicitud de patente WO 99/43793, por ejemplo, se describe un desarrollo de la conocida a-amilasa Novamyl®. En este caso, se aprovechan las similitudes de secuencia entre Novamyl® y las ciclodextringlucanotransferasas (CGTasas) conocidas para construir un grupo de moléculas emparentadas con la ayuda de técnicas de biología molecular. Se trata de a-amilasas con secuencias consenso adicionales, específicas de CGTasa (cajas) y funciones o, a la inversa, de CGTasas con áreas y funciones adicionales, típicas para las a-amilasas, o bien de quimeras de ambas moléculas. El sentido de este desarrollo consiste en optimizar Novamyl® para estas aplicaciones.

La solicitud de patente WO 99/57250, por ejemplo, da a conocer una teoría sobre cómo enlazar enzimas apropiadas para ser utilizadas en agentes de lavado y limpieza a través de un enlazador químico con un dominio de enlace para aumentar la concentración efectiva de enzimas sobre el objeto a limpiar.

Una tendencia moderna en el desarrollo de las enzimas consiste en combinar elementos de proteínas conocidas, emparentadas entre sí, mediante procedimientos estáticos para formar nuevas enzimas que presentan propiedades que no se habían conseguido hasta el momento. Estos procedimientos se conocen con el término genérico "Directed Evolution" (evolución dirigida) . Entre ellos se encuentran, por ejemplo: El método StEP (Zhao y otros (1998) , Nat. Biotechnol., tomo 16, p. 258-261) , Random priming recombination (Shao y otros, (1998) , Nucleic Acids Res., tomo 26, p. 681-683) , DNA-Shuffling (Stemmer, W.P.C. (1994) , Nature, tomo 370, p. 389-391) , o RACHITT (Coco, W.M. y otros (2001) , Nat. Biotechnol., tomo 19, p. 354-359) .

La condición previa para la recombinación mediante estos procedimientos es que los ácidos nucleicos utilizados presenten regiones suficientemente largas para conseguir una hibridación en las condiciones respectivas. Para que la hibridación tenga éxito, en las secuencias de partida más del 45% de las identidades han de ser consideradas como practicables entre sí a nivel de los aminoácidos, para forzar la recombinación homóloga más del 50%. Almenos dos secuencias distintas, homólogas entre sí, ya definen un espacio de secuencias. Éste contiene todas las secuencias nuevas que pueden ser derivadas teóricamente a partir de las secuencias de partida mediante la recombinación. Para ello también pueden presentar valores de homología de menos del 45%, siempre que los ácidos nucleicos derivados de ellas pueden ser recombinados de acuerdo con un método establecido según el estado de la técnica.

A pesar de todos estos desarrollos, sigue existiendo sin variación el objetivo de encontrar, además de las pocas enzimas amilolíticas naturales, que son realmente aprovechadas en la industria sin modificaciones o en forma de desarrollos más avanzados, otras que presenten a priori un amplio espectro de aplicación y que puedan servir como punto de partida para desarrollos específicos de aplicación, especialmente para procedimientos de recombinación estadística.

La variedad genética de las bacterias gram-positivas del orden de los actinomicetales, especialmente de la especie Streptomyces a penas ha sido examinada hasta el momento en lo que se refiere a proteínas amilolíticas que son apropiadas para fines técnicos. En este contexto sólo se han de tener en cuenta dos solicitudes de patente japonesas. En la solicitud de patente JP-A 62-143999 se da a conocer una a-amilasa adecuada para su utilización en agentes de lavado y limpieza procedente de un representante de la especie Streptomyces. Este organismo Streptomyces sp. KSM-9 o FERM P-7620 proviene de un hábitat natural y crece en un medio alcalino. En este documento, la enzima amilolítica sólo se describe a través de parámetros enzimáticos y su aptitud para ser utilizada en agentes de lavado y limpieza, pero no en lo que se refiere a su secuencia de ADN o de aminoácidos.

La enzima que se da a conocer por la solicitud de patente JP-A 2000-60546 y proviene del Streptomyces sp. TOTO9805 o FERM BP-6359 presenta propiedades enzimáticas similares a las de la enzima que proviene del Streptomyces sp. KSM-9. En esta solicitud, sin embargo, las características también se refieren sólo a parámetros enzimáticos y no a la secuencia de aminoácidos o de nucleótidos. Debido a ello, ambas amilasas no están disponibles ni para una expresión y obtención heterólogas, ni para una selección y optimización específica en cuanto a su aplicación. Ya que tanto... [Seguir leyendo]

1. Proteína amilolítica cuya secuencia de aminoácidos contiene una porción que es idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 208 en un 95%, preferentemente en un 97, 5% y muy preferentemente en un 100%.

2. Proteína amilolítica obtenida mediante mutación por inserción o proteína amilolítica quimérica que está formada, al menos en una porción que confiere una actividad amilolítica, por una proteína, según la reivindicación 1.

3. Proteína amilolítica, según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque se obtiene a partir de un organismo natural, en especial a partir de un microorganismo.

4. Proteína amilolítica, según la reivindicación 3, caracterizada porque el microorganismo es una bacteria grampositiva.

5. Proteína amilolítica, según la reivindicación 4, caracterizada porque la bacteria gram-positiva pertenece al orden de los actinomicetales.

6. Proteína amilolítica, según la reivindicación 5, caracterizada porque se trata de una especie de Streptomyces.

7. Ácido nucleico que codifica para una proteína amilolítica cuya secuencia de aminoácidos contiene una porción que es idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 208 en un 95%, preferentemente en un 97, 5% y muy preferentemente en un 100%.

8. Ácido nucleico que codifica para una de las proteínas amilolíticas indicadas en la reivindicación 2.

9. Utilización de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6, para la identificación de una proteína amilolítica.

10. Utilización de un ácido nucleico, según una de las reivindicaciones 7 u 8, para la identificación y/u obtención de una nueva amilasa.

11. Vector que contiene una región de ácido nucleico indicada en las reivindicaciones 7 u 8.

12. Vector de clonación, según la reivindicación 11.

13. Vector de expresión, según la reivindicación 11.

14. Célula huésped que expresa una de las proteínas, en forma recombinante, indicadas en las reivindicaciones 1 a 6 o que puede ser estimulada a su expresión utilizando un vector de expresión, en forma recombinante, según la reivindicación 13.

15. Célula de huésped, según la reivindicación 14, caracterizada porque es una bacteria, en especial una bacteria que segrega la proteína generada al medio circundante.

16. Célula huésped, según la reivindicación 15, caracterizada porque es una bacteria gram-positiva.

17. Célula huésped, según la reivindicación 16, caracterizada porque pertenece al género Bacillus, preferentemente a las especies Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis o Bacillus alcalophilus.

18. Célula huésped, según la reivindicación 15, caracterizada porque es una bacteria gram-negativa.

19. Célula huésped, según la reivindicación 18, caracterizada porque pertenece al género Escherichia, preferentemente a la especie Escherichia coli, muy preferente a una de las cepas E. Coli JM 109, E. Coli DH 100B o

E. Coli DH 12S.

20. Célula huésped, según la reivindicación 14, caracterizada porque es una célula eucariota, en especial una que modifica de forma postranslacional la proteína generada.

21. Procedimiento para la obtención de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6, utilizando un ácido nucleico, según una de las reivindicaciones 7 u 8, y/o utilizando un vector, según una de las reivindicaciones 11 a 13, y/o utilizando una célula huésped, según una de las reivindicaciones 14 a 20, o utilizando una célula que genera ésta de forma natural.

22. Agente de lavado o limpieza, caracterizado porque contiene una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a

6.

23. Utilización de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6, para el tratamiento de materias primas o productos intermedios en la fabricación de textiles, en especial para el desencolado de algodón.

24. Procedimiento para la licuación de almidón, en especial para la producción de etanol, caracterizado porque se utiliza una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6.

25. Utilización de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6, para la obtención de oligosacáridos lineales y/o de cadena corta.

26. Utilización de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6, para la hidrólisis de ciclodextrinas.

27. Utilización de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6, para la liberación de compuestos de bajo peso molecular a partir de portadores de polisacáridos o ciclodextrinas.

28. Utilización de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6, para la fabricación de alimentos y/o ingredientes alimentarios.

29. Utilización de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6, para la fabricación de piensos para animales y/o ingredientes de piensos.

30. Utilización de una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6, para la disolución de uniones pegadas que contienen almidón.

31. Procedimiento de pegado temporal, caracterizado porque se utiliza una proteína, según una de las reivindicaciones 1 a 6.