NUEVAS POLIQUÉTIDO-SINTETASAS PRODUCTORAS DE ESPINOSINA.

Un compuesto seleccionado de:

21-desetil-21-ciclopropil-espinosina A;

21-desetil-21-ciclopropil-espinosina D;

21-desetil-21-ciclobutil-espinosina A;

21-desetil-21-ciclobutil-espinosina D;

21-desetil-21-metiltiometil-espinosina A;

21-desetil-21-metiltiometil-espinosina D;

21-desetil-21-cianometil-espinosina A;

5,6-dihidro-21-desetil-21-ciclobutil-espinosina A;

21-desetil-21-isopropil-espinosina A;

21-desetil-21-isopropil-espinosina D;

21-desetil-21-sec-butil-espinosina A;

21-desetil-21-sec-butil-espinosina D;

21-desetil-21-metilciclopropil-espinosina A;

21-desetil-21-metilciclopropil-espinosina D;

21-desetil-21-(3-furil)-espinosina A;

21-desetil-21-(3-furil)-espinosina D;

21-desetil-21-ciclopropil-espinosina A 17-pseudoaglicona;

21-desetil-21-ciclopropil-espinosina D 17-pseudoaglicona;

21-desetil-21-ciclobutil-espinosina A 17-pseudoaglicona;

21-desetil-21-ciclobutil-espinosina D 17-pseudoaglicona.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2003/004998.

Solicitante: DOW AGROSCIENCES LLC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 9330 ZIONSVILLE ROAD INDIANAPOLIS, INDIANA 46268 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: LEWER, PAUL, GRAUPNER, PAUL, R., WALDRON,CLIVE, SHEEHAN,Lesley S, MARTIN,Christine J, VOUSDEN,William A, WILKINSON,Barrie.

Fecha de Publicación: 5 de Marzo de 2012.

Clasificación Internacional de Patentes:

A01M17/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01M CAPTURA O CAZA DE ANIMALES, AHUYENTADORES PARA ANIMALES (dispositivos para la captura de enjambres o zánganos A01K 57/00; pesca A01K 69/00 - A01K 97/00; biocidas, pesticidas, productos que atraen o repelen a los animales A01N ); APARATOS DE DESTRUCCION DE ANIMALES O PLANTAS PERJUDICIALES. › Aparatos para la destrucción de los parásitos en el suelo o en los alimentos.
A01N43/04 A01 […] › A01N CONSERVACION DE CUERPOS HUMANOS O ANIMALES O DE VEGETALES O DE PARTES DE ELLOS (conservación de alimentos o productos alimenticios A23 ); BIOCIDAS, p. ej. EN TANTO QUE SEAN DESINFECTANTES, PESTICIDAS O HERBICIDAS (preparaciones de uso médico, dental o para el aseo que eliminan o previenen el crecimiento o la proliferación de organismos no deseados A61K ); PRODUCTOS QUE ATRAEN O REPELEN A LOS ANIMALES; REGULADORES DEL CRECIMIENTO DE LOS VEGETALES. › A01N 43/00 Biocidas, productos que atraen o repelen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen compuestos heterocíclicos (que contienen anhídridos cíclicos, imidas cíclicas A01N 37/00; que contienen compuestos de fórmula , que no tienen más que un heterociclo en los que m≥1 y n≥0 y es una pirrolidina, una piperidina, una morfolina, una tiomorfolina, una piperazina o una polimetilenoimina, no sustituida o sustituida por un alcoilo, que tiene al menos cuatro grupos CH 2 A01N 33/00 - A01N 41/12; que contienen ácidos ciclopropanocarbhoxílicos o sus derivados, p. ej. ésteres con heterociclos, A01N 53/00). › con un heteroátomo.
A01N45/00 A01N […] › Biocidas, productos que repelen o atraen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen compuestos que tienen al menos tres ciclos carbocíclicos condensados entre sí, siendo al menos uno de los ciclos de un número de elementos distinto a seis (hidrocarburos halogenados A01N 29/08; condensados con heterocíclicos A01N 43/00).
C07H17/08 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 17/00 Compuestos que contienen radicales heterocíclicos unidos directamente a los heteroátomos de los radicales sacárido. › Heterociclos que contienen ocho o más miembros cíclicos, p. ej. eritromicinas.
C07H21/04 C07H […] › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
C12N1/15 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
C12N1/19 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
C12N15/52 C12N 15/00 […] › Genes que codifican enzimas o proenzimas.
C12N5/00 C12N […] › Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00).
C12N5/02 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Propagación de células individuales o de células en suspensión; Su conservación; Medios de cultivo para este fin.
C12N5/10 C12N 5/00 […] › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
C12N9/00 C12N […] › Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas.
C12P1/04 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 1/00 Preparación de compuestos o de composiciones, no prevista en los grupos C12P 3/00 - C12P 39/00, utilizando microorganismos o enzimas; Procedimientos generales de preparación de compuestos o composiciones que utilizan microorganismos o enzimas. › utilizando bacterias.
C12P19/62 C12P […] › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › teniendo el heterociclo al menos ocho miembros y sólo oxígeno como heteroátomo del ciclo, p. ej. eritromicina, espiramicina, nistatina.

PDF original: ES-2375714_T3.pdf

Fragmento de la descripción:

Nuevas poliquétido-sintetasas productoras de espinosina.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona compuestos biológicamente activos producidos por organismos hospedadores 5 que incluyen, pero sin carácter limitante, cepas de Saccharopolyspora spinosa transformadas por incorporación de DNA híbrido de poliquétido-sintetasa.

Antecedentes de la invención

Como se describe en US Pat. No. 5.362.634, el producto de fermentación A83543 es una familia de compuestos afines producidos por Saccharopolyspora spinosa. La familia de compuestos naturales de espinosina que han sido aislados previamente se describe en US Pat. No. 6.274.350 B1 y WO 01/19840, junto con sus actividades en una diversidad de ensayos de control de insectos. Cierto número de análogos semi-sintéticos de espinosina se describen también en US Pat. No. 6.001.981, en los cuales las áreas químicamente accesibles de la molécula de espinosina estaban sustituidas con éxito de diversas maneras.

Los miembros conocidos de esta familia se han dado a conocer como factores o componentes, y cada uno de ellos ha recibido una letra de designación identificadora. A estos compuestos se hace referencia en lo sucesivo como espinosina A, B, etc. Los compuestos de espinosina son útiles para el control de arácnidos, nematodos e insectos, en particular especies de Lepidópteros y Dípteros, son totalmente respetuosos con el medio ambiente y tienen un perfil toxicológico atractivo. El producto comercial Spinosad es una mixtura de espinosinas A y D (Pesticide Manual, edición 11ª, p. 1272) .

Las Tablas 1 y 2 identifican las estructuras de algunos compuestos de espinosina conocidos:

Tabla 1

Factor R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 espinosina A H CH3 (a) C2H5 CH3 CH3 CH3 espinosina B H CH3 (b) C2H5 CH3 CH3 CH3 espinosina C H CH3 (c) C2H5 CH3 CH3 CH3

Factor R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 espinosina D CH3 CH3 (a) C2H5 CH3 CH3 CH3 espinosina E H CH3 (a) CH3 CH3 CH3 CH3 espinosina F H H (a) C2H5 CH3 CH3 CH3

espinosina A 17-Psa H

CH3

C2H5

CH3

espinosina D 17-Psa CH3 CH3 H C2H5 CH3 CH3 CH3 espinosina E 17-Psa H CH3 H CH3 CH3 CH3 CH3 espinosina F 17-Psa H H H C2H5 CH3 CH3 CH3

Tabla 2

Factor R1 R2 R3 R4 R5 espinosina A 9- Psa H CH3 (a) C2H5 H espinosina D 9- Psa CH3 CH3 (a) C2H5 H espinosina A aglicona H CH3 H C2H5 H espinosina D aglicona CH3 CH3 H C2H5 H

Los compuestos de espinosina producidos naturalmente están constituidos por un sistema de anillos 5, 6, 5-tricíclico, fusionado a una lactona macrocíclica de 12 miembros, un azúcar neutro (ramnosa) y un aminoazúcar (forosamina)

(véase Kirst et al., (1991) ) . Cuando no está presente el aminoazúcar, se hace referencia a los compuestos como pseudoaglicona de A, D, etc., y si no está presente el azúcar neutro se hace referencia entonces a los compuestos como la pseudoaglicona inversa de A, D, etc. Una nomenclatura más preferida consiste en hacer referencia a las pseudoagliconas como espinosina A 17-Psa, espinosina D 17-Psa, etc., y a las pseudoagliconas inversas como espinosina A 9-Psa, espinosina D 9-Psa, etc.

Los compuestos de espinosina producidos naturalmente pueden producirse por fermentación de los cultivos NRRL 18395, 18537, 18538, 18539, 18719, 18720, 18743 y 18823. Estos cultivos han sido depositados y forman parte de la condición de cultivos stock del Midwest Area Northern Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, IL 61604.

U.S. Pat. No. 5.362.634 y la Solicitud de Patente Europea correspondiente No. 375316 A1 describen las espinosinas 15 A, B, C, D, E, F, G, H y J. Estos compuestos se describen como producidos por cultivo de una cepa del nuevo

microorganismo Saccharopolyspora spinosa seleccionado de NRRL 18395, NRL 18537, NRRL 18538, y NRRL 18539.

WO 93/09126 describía las espinosinas L, M, N, Q, R, S y T. En dicho documento se describen también dos cepas productoras de espinosina J: NRRL 18719 y NRRL 18720, y una cepa que produce las espinosinas Q, R, S, y T: NRRL 18823.

WO 94/20518 y US Pat. No. 5.670.486 describen las espinosinas K, O, P, U, V, W, e Y, y derivados de las mismas. Se describe también la cepa productora de espinosina K NRRL 18743.

WO 01/19840 describe análogos de espinosina producidos por cultivo de la especie de Saccharopolyspora LW107129 (NRRL30141) .

WO 99/46387 y US Pat. No. 6.143.526 describen los genes biosintéticos de espinosina de Saccharopolyspora spinosa.

La naturaleza de los genes implicados en la biosíntesis de espinosina, junto con estudios previos de incorporación de precursores (Broughton et al., 1991) , indican que las espinosinas son producidas por la condensación gradual de ácidos carboxílicos de 2 carbonos y 3 carbonos para generar un poliquétido que se cicla y se puentea. El producto aglicona tetracíclico de estas reacciones se convierte en la pseudoaglicona por adición de un residuo ramnosilo, y la síntesis se completa por la adición del azúcar di-metilado en N, forosamina. En algunos aspectos, este proceso es similar al camino de biosíntesis por el cual se producen otros macrólidos (tales como el antibiótico eritromicina, el antihelmíntico avermectina, y el inmunosupresor rapamicina) . En particular, el núcleo del poliquétido está ensamblado por una proteína multifuncional muy grande, que es una poliquétido-sintetasa Tipo I (spn PKS) . Este polipéptido complejo comprende un módulo de carga y diez módulos de extensión, siendo cada módulo responsable tanto de la adición de un precursor acil-CoA específico a la cadena del poliquétido en crecimiento, y del grado de reducción del grupo º-ceto-carbonilo. Cada módulo realiza varias reacciones bioquímicas que son llevadas a cabo por dominios específicos del polipéptido. Todos los módulos de extensión contienen un dominio acil-transferasa (AT) que dona el grupo acilo de un precursor a un dominio de proteína portadora de acilo (ACP) y un dominio ºcetosintetasa (KS) que añade la cadena de poliquétido pre-existente a la nueva acil-ACP por condensación descarboxilante. En algunos módulos de extensión están presentes dominios adicionales: los dominios ºcetorreductasa (KR) reducen los grupos º-ceto a hidroxilos, los dominios deshidratasa (DH) eliminan hidroxilos para dejar enlaces dobles, y el dominio enoil-reductasa (ER) reduce un enlace doble para dejar un carbono saturado. El módulo de carga de la spn PKS es diferente de los módulos de extensión por el hecho de que contiene un dominio KS variante (KSq) , así como dominios AT y ACP. El dominio KSq, que se encuentra también en algunos otros módulos de carga PKS Tipo I (pero no en todos) , se cree que proporciona la unidad iniciadora requerida por descarboxilación de una cadena acilo unida a ACP (Bisang et al., 1999) . El módulo de extensión terminal contiene un dominio de tioesterasa/ciclasa (TE) que libera la cadena de poliquétido de la PKS.

La región de DNA de la espinosina PKS está constituida por 5 ORFs con codones de parada en marco al final de algunos dominios ACP, similares a los ORFs de la PKS en las otras bacterias productoras de macrólidos. Los cinco genes de espinosina PKS están dispuestos cabeza con cola, sin ninguna función interpuesta distinta de PKS tal como el elemento de inserción encontrado entre los genes PKS de eritromicina AI y AII (Donadio et al., 1993) . Los mismos se designan spnA, spnB, spnC, spnD y spnE. La secuencia de nucleótidos para cada uno de los cinco genes PKS de espinosina, y los polipéptidos correspondientes, se identifican en el documento US Pat. No.

6.143.526 y en Waldron et al., 2001. Se identifican también en estas fuentes los productos de traducción predichos de los genes PKS, y los límites de los dominios y módulos.

Después de su síntesis, el precursor del poliquétido espinosina se condensa para formar una lactona macrocíclica, a la que se hace referencia en lo sucesivo como el núcleo del poliquétido. La producción de espinosinas activas con insecticidas requiere el procesamiento adicional del núcleo del poliquétido. En primer lugar, tienen que formarse puentes carbono-carbono entre C3 y C14, C4 y C12, y C7 y C11, para generar la aglicona intermedia. Posibles mecanismos para estas reacciones no usuales han sido sugeridos (Waldron et al., 2001) , pero las características estructurales del sustrato de poliquétido... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones:

1. Un compuesto seleccionado de.

2. desetil-21-ciclopropil-espinosina A.

2. desetil-21-ciclopropil-espinosina D;

21-desetil-21-ciclobutil-espinosina A.

2. desetil-21-ciclobutil-espinosina D.

2. desetil-21-metiltiometil-espinosina A.

2. desetil-21-metiltiometil-espinosina D.

2. desetil-21-cianometil-espinosina A;

5, 6-dihidro-21-desetil-21-ciclobutil-espinosina A.

2. desetil-21-isopropil-espinosina A.

2. desetil-21-isopropil-espinosina D.

2. desetil-21-sec-butil-espinosina A.

2. desetil-21-sec-butil-espinosina D;

21-desetil-21-metilciclopropil-espinosina A.

2. desetil-21-metilciclopropil-espinosina D.

2. desetil-21- (3-furil) -espinosina A.

2. desetil-21- (3-furil) -espinosina D.

2. desetil-21-ciclopropil-espinosina A 17-pseudoaglicona;

21-desetil-21-ciclopropil-espinosina D 17-pseudoaglicona.

2. desetil-21-ciclobutil-espinosina A 17-pseudoaglicona.

2. desetil-21-ciclobutil-espinosina D 17-pseudoaglicona.

Pptr producto PCR 112 pb

Clon Pptr como SpeI/NdeI en pCJR24

pUC18 2686 pb Producto del clon PCR en pUC18_SmaI pRIS4 2, 78 kpb pCJR24 4682 pb pCJR81 3585 pb Figura 1

pKC1132 3, 50 kpb Enlazador del clon CR311/CR312 en pKC1132_PvuII pLSB1 3, 30 kpb Insertar actII-ORF4 y Insertar Pptr como un PactI como un fragmento fragmento SpeI/NdeI SpeI/NdeI de pCJR24 de pCJR81 pLSB2 4, 48 kpb pLSB3 3, 38 Kb Figura 2

pUC19 pLSB5 fragmento

2686 pb 4264 pb

spnA

PCR del fragmento spnA de cos3E11 con SP14 y SP15. Clonar en pUC19_SmaI Clonar el fragmento de 2, 6 kpb BstEII/NotI de cos3E11 en pLSB5_ BstEII/NotI

Clonar la carga ave como un fragmento NdeI/NheI de pIG1

carga ave en pLSB8_ NdeI/NheI fragmento pLSB14 pLSB8 spnA 8346 pb 6892 pb

fragmento spnA Clonar el fragmento NdeI/XbaI en pLSB2_ NdeI/XbaI

pLSB29 carga ave10, 36 Kb

fragmento spnA

Figura 5

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