MUTEÍNAS DE SITIO DE GLUCOSILACIÓN TLR3 Y PROCEDIMIENTOS DE USO.

Una cadena peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.

º: 6 y al menos una mutación en 3 residuos de aminoácidos de un alineamiento de posición con N636 de la secuencia de aminoácidos SEC ID N.º: 6.

Muteínas de sitio de glucosilación Tlr3 y procedimientos de uso Campo de la invención La presente invención se refiere a muteínas de sitio de glucosilación TLR3, a ácidos nucleicos que codifican las muteínas y a procedimientos de modular la actividad de TLR3 en una célula.

Antecedentes de la invención Las patologías asociadas con afecciones inflamatorias representan un reto significativo en el cuidado de la salud y pueden ser dolorosas, debilitantes y letales. Por ejemplo, la sepsis y las afecciones asociadas a sepsis afectan a más de 750.000 personas anualmente en los EE.UU. con índices de mortalidad de 28-50%, dando como resultado 215.000 muertes anuales (Natanson y cols., Crit. Care Med. 26: 1927-1931 (1998) ; Angus y cols., Crit. Care Med.

29: 1303 -1310 (2001) ) . Otras afecciones inflamatorias tales como las enfermedades inflamatorias del intestino (IBD) enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa afectan a más de 1 millón de personas por año en los EE.UU. (Hanauer y cols., Rev. Gastroenterol. Disord. 3: 81-92 (2003) ) .

Las afecciones pulmonares inflamatorias que afectan la función de pulmón tales como enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , asma e infecciones del pulmón también afectan números significativos de personas en los EE.UU. COPD, por ejemplo, afecta a unos 10 millones de adultos estimados y la prevalencia está aumentando (Mapel y col., Manag. Care Interface 17: 61-66 (2004) ) . Las patologías asociadas con estas afecciones inflamatorias y con exacerbaciones de estas afecciones tienen impactos significativos en la salud y económicos.

La exacerbación en enfermedades pulmonares tales como asma y COPD se caracteriza por el empeoramiento de los síntomas y por un declive en la función pulmonar. Las infecciones víricas están asociadas con exacerbaciones de muchas enfermedades pulmonares (Johnston, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 152: S46-52 (1995) ; Bandi y cols., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 37: 69-75 (2003) ) y se cree que son una causa principal de exacerbaciones. La secreción de citocinas proinflamatorias en los pulmones tras infección vírica representa una etapa crucial en promover la respuesta inflamatoria en diversas enfermedades pulmonares (Gern y col., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 28: 731-737 (2003) ; Panina-Bordignon y col., Curr. Opin. Pulm. Med. 9: 104-110 (2003) ) .

El reconocimiento de antígenos microbianos por el sistema inmunitario del huésped está mediado a través de receptores inmunes innatos, cuya activación representa un paso importante en la iniciación de una respuesta inflamatoria. Los receptores de peaje (TLR) representan una familia de receptores inmunes innatos que juegan un papel crucial en mediar una respuesta inmune a antígenos extraños. TLR3, por ejemplo, es un receptor de reconocimiento de patrón de mamíferos que reconoce ARN de doble hebra (ds) así como el análogo de ARN de doble hebra ácido polirriboinosinicribocitidílico (poli I:C) , (Alexopoulou y cols., Nature 413: 732-238 (2001) ) . Además, se ha mostrado que TLR3 reconoce ligandos endógenos tales como ARNm liberado de células necróticas (Kariko y cols., J. Biol. Chem. 26: 12542-12550 (2004) ) indicando que la muerte celular necrótica en los sitios inflamatorios puede contribuir a activación de TLR3. Una secuencia aminoacídica humana de longitud total TLR3 y una secuencia polinucleotídica codificante se muestra en la SEC ID Nº : 1 y la SEC ID Nº : 2, respectivamente.

La activación de TLR3 por el análogo de ARN vírico poli (I:C) o por ligandos de ARNm endógenos induce secreción de citocinas y quimiocinas, un hallazgo que indica que la activación de TLR3 modula los resultados de la enfermedad durante la inflamación asociada a infección. Así, se piensa que la ligazón de TLR3 in vivo tiene lugar en el contexto de la infección vírica (Tabeta y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 101: 3516-3521 (2004) ) o de la necrosis asociada con inflamación (Kariko y cols., J. Biol. Chem. 26: 12542-12550 (2004) ) . En general, estos datos demuestran que la ligazón de TLR3 inicia cascadas de fosforilación y eventos de activación transcripcional que dan como resultado la producción de numerosas citocinas inflamatorias que se piensa que contribuyen a la inmunidad innata (revisada por Takeda y Akira, J. Derm. Sci. 34: 73-82 (2004) ) . Adicionalmente, estos datos sugieren que la activación de TLR3 sostenida puede ser un componente crítico en la modulación de enfermedades inflamatorias asociadas con infección. Los datos publicados dan respaldo a esta hipótesis como se muestra por hallazgos que asocian sobreproducción de citocinas proinflamatorias con síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, asaltos de citocinas agudos asociados con infecciones (revisados por Van Amersfoort y cols., Clin. Microbiol. Rev. 16: 379-414 (2003) ) y afecciones crónicas mediadas por el sistema inmune tales como artritis reumatoide (revisados por Miossec y cols., Curr. Opin. Rheumatol. 16: 218-222 (2004) ) y enfermedades intestinales antiinflamatorias (revisados por Ogata e Hibi, Curr. Pharm. Des. 9: 1107-1113 (2003) ) .

De forma importante, está llegando a estar claro que la actividad TLR3 también juega un papel significativo en afecciones tales como síntomas de enfermedad inflamatoria del intestino, sepsis, patologías pulmonares mediadas por citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento y afecciones inflamatorias pulmonares que resultan de infiltración de células inflamatorias incrementada en tejidos pulmonares. Sin embargo, ha estado poco claro, si hay alguno, el efecto que tiene glucosilación de TLR3 sobre actividad de TLR3 y sobre las afecciones mediadas por TLR3.

Así, existe una necesidad para entender el efecto de glucosilación de TLR3 en actividad de TLR3 y para explotar esta información para desarrollar composiciones y métodos que modulen eficazmente actividad de TLR3.

Breve descripción de los dibujos El panel (A) de la figura 1 muestra espectros de masas de MALDI-TOF de dominio extracelular de hTLR3 (ECD) y el panel (B) muestra espectros de masas MALDI-TOF de ECD de hTLR3 tratados con desglucosidasas.

La figura 2 muestra en efecto de N-glucosilación con tunicamicina en activación inducida por poli (I:C) de señalización de hTLR3 en células HEK293.

La figura 3 muestra el efecto de N-glucosilación de ECD por mutagénesis de N247, N252, o N413 en hTLR3 (SEC ID Nº : 2) en activación de señalización de hTLR3 en células. El panel (A) es un alineamiento de sitios de Nglucosilación posibles a partir de homólogos de hTLR3 seleccionados; paneles (B) y (C) son ensayos de activación de hTLR3 llevados a cabo con los mutantes de hTLR3 indicados en 10 !g/ml (B) o 2, 5 !g/ml (C) del ligando de hTLR3 poli (I:C) .

La Fig. 4 muestra el efecto de N-glucosilación de ECD de hTLR3 por mutagénesis de N247, N252, o N662 de hTLR (SEC ID Nº : 2) en activación de señalización de hTLR3 inducida por poli (I:C) en células.

Sumario de la invención Un aspecto de la invención es una cadena peptídica que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 6 y al menos una mutación en 3 residuos de aminoácidos de un alineamiento de posición con N636 de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº : 6.

Otro aspecto de la invención es una cadena peptídica que comprende al menos una mutación en 3 residuos de aminoácidos de posición N636 de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº : 6.

Otro aspecto de la invención es una cadena peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº : 14, la SEC ID Nº : 18 o la SEC ID Nº : 20.

Otro aspecto de la invención es un procedimiento de modular la actividad de TLR3 en una célula que comprende disminuir glucosilación de TLR3 en la célula en la que la modulación es atenuación.

Descripción detallada de la invención El término "homólogos" quiere decir secuencias de proteínas que tienen identidad de secuencia entre el 40 % y el 100 % para una secuencia de referencia. Los homólogos de hTLR3 incluyen cadenas peptídicas de otras especies que tienen entre el 40% y el 100% de identidad de secuencia para una secuencia de hTLR3 conocida. Los términos "homólogo a TLR3" y "TLR3" se utilizan intercambiablemente por toda la memoria descriptiva y reivindicaciones.

El término "cadena peptídica" como se usa en el presente documento comprende al menos dos aminoácidos que se dan de forma natural o de forma no natural unidos por enlaces peptídicos.

El término "actividad TLR3" como se usa en el presente documento... [Seguir leyendo]

1. Una cadena peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 6 y al menos una mutación en 3 residuos de aminoácidos de un alineamiento de posición con N636 de la secuencia de aminoácidos 5 SEC ID Nº : 6.

2. Una cadena peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos, SEC ID Nº : 14, SEC ID Nº : 18 o SEC ID Nº : 20.

3. Un ácido nucleico que codifica la cadena peptídica de la reivindicación 1 ó 2.

4. El ácido nucleico de la reivindicación 3 que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de, SEC ID Nº : 10 13, SEC ID Nº : 17 o SEC ID Nº : 19.

5. La cadena peptídica de la reivindicación 1 ó 2 para usar en un procedimiento de modular actividad TLR3 en una célula, en la que la modulación es atenuación.

6. El ácido nucleico de la reivindicación 3 para usar en un procedimiento de modular actividad TLR3 en una célula, en la que la modulación es atenuación.

Fig. 1 Fig. 2 Fig. 3 Fig. 4