Un método para detectar una célula de neoplasma melanocítico en una muestra biológica procedente de un paciente,

comprendiendo dicho método:

detectar la presencia o la ausencia de una mutación activadora en un gen Gnaq en la muestra biológica, en el que la presencia de la mutación es indicativa de la presencia de células de neoplasma melanocítico en la muestra biológica.

Mutaciones de Gnaq en el melanoma.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EEUU nº 60/900.479, presentada el 8 de febrero de 2007.

Declaración acerca de los derechos a invenciones realizadas en investigaciones o avances con financiación federal

Esta invención se realizó con apoyo del Gobierno a través de la beca nº P01 CA 025874-25-A1 concedida por the National Institutes of Health. El Gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.

Antecedentes de la invención

El modelo actual de formación del melanoma consiste en que los melanocitos avanzan desde un estado normal a un estado maligno mediante la acumulación de mutaciones en genes de melanoma clave. Véase, Meier, F., et al. (1998) , Frontiers in Bioscience, 3:D1005-1010. El melanoma puede surgir de modo espontáneo, o dentro de un nevus o lunar preexistente. Los nevi poseen mutaciones en genes de melanoma conocidos y, por tanto, son un factor de riesgo para el desarrollo del melanoma. Véase, por ejemplo, Pollock, P.M., et al. (2003) , Nat. Genet., 33 (1) :19-20; Kumar, R., et al. (2004) , J. Invest. Dermatol., 122 (2) :342-348; Chin, L. (2003) , Nat. Rev. Cancer, 3 (8) :559-570.

Se ha demostrado que la mayoría de los melanomas y nevi melanocíticos humanos poseen mutaciones activadoras en los genes BRAF, NRAS, C-KIT, o HRAS. Por ejemplo, el documento WO 2005/059171 describe el uso de una mutación en el gen BRAF para la determinación de la malignidad de células de melanoma. Además, estudios recientes han demostrado que los melanomas se encuadran en grupos genéticamente diferenciados que tienen diferencias marcadas en la frecuencia de la activación de la vía de MPA-quinasa. Véase, Curtin, J.A., et al. (2005) ,

N. Engl. J. Med., 353 (20) :2135-2147. Una categoría, el melanoma uveal, surge de melanocitos dentro del plexo coroidal del ojo y es biológicamente diferente del melanoma cutáneo por alteraciones citogenéticas características. Véase, Horsman et al. (1993) , Cancer, 71 (3) :811. La otra categoría la forman las proliferaciones melanocíticas intradérmicas, que pueden ser congénitas o adquiridas, y se presentan en diversas formas, que varían de lunares azulados discretos (nevi azules) a grandes parches de color azul grisáceo que afectan a la conjuntiva y a la piel periorbital (nevus de Ota) , los hombros (nevus de Ito) , y la zona lumbar (mancha mongoliana) . Véase, Zembowicz, et al. (2004) , Histopathologym 45 (5) :433. Estas proliferaciones melanocíticas intradérmicas no contienen mutaciones en BRAF ni NRAS, y por tanto tienen una etiología exclusiva cuando se comparan con otros nevi y melanomas. Véase, Ariyanayagam-Baksh S.M., et al. (2003) , Am. J. Dermatopathol., 25 (1) : p. 21-27. Los melanomas uveales muestra una activación de la MAP-quinasa (véase, Zuidervaat et al. (2005) , British J. Cancer, 92 (11) :2032) pero generalmente no presentan mutaciones en BRAF, NRAS, o KIT. Aunque el melanoma uveal se diagnostica en EEUU a una tasa de 4, 3-6 casos por millón anuales, un estudio previo de 1250 individuos caucásicos con melanoma uveal encontró sólo 17 pacientes (1, 4%) con melanocitosis ocular u oculodérmica. Véase, Gonder J.R., et al. (1982) , Ophthalmology, 89 (8) : 953-960. Se ha sugerido una conexión potencial entre los neoplasmas menalocíticos intradérmicos y los melanomas uveales por el hecho de que el nevus de Ota es un factor de riesgo para el melanoma uveal y por un solapamiento entre algunas características histomorfológicas de los dos trastornos, y se ha indicado que los dos aparecen juntos. Véase, López, M.T., et al. (1998) , Am. J. Dermatopathol., 20:109-110; Singh, A.D., et al. (1998) , Opthamol., 105 (1) :195.

En fechas recientes, una investigación de mutagénesis a gran escala en ratones ha identificado varios mutantes de piel oscura (Dsk) . Véase, Van Raamsdonk C.D., et al. (2004) , Nat. Genet., 36: 961-968. Algunos de estos mutantes tienen un fenotipo melanocítico con una proliferación celular escasa de melanocitos intradérmicos que se parece a los nevi azules. Se demostró que las mutaciones eran el resultado de mutaciones en subunidades a de la proteína

G.

Las proteínas G representan una gran familia deproteínas heterotriméricas que se encuentran en mamíferos compuestas por subunidades alfa (a) , beta (1) , y gamma (y) . Véase, Wettschureck, N.A.O.S. (2005) , Physiol. Rev., 85 (4) :1159-1204. La subunidad G-aq es una de una diversidad de subunidades G-alfa que media en la estimulación de la fosfolipasa C1 a través de la unión y la hidrólisis de GTP. Véase, Markby, D.W., et al. (1993) , Science, 262 (1541) :1895-1901. Se ha propuesto la hipótesis de que la activación de G-aq estimula la supervivencia de los melanocitos en la dermis. Véase, Van Raamsdonk, C.D., et al. (2004) . Esto resulta coherente con la observación en ratones de que la hiperactividad de G-aq aumenta el número de melanoblastos, melanocitos inmaduros, que migran en la dermis sin aumentar su tasa mitótica. Véase, Van Raamsdonk, C.D., et al. (2004) .

Las mutaciones hipermórficas en la línea germinal en Gaq en ratones provocan hiperpigmentación dérmica, sin

y GnaqDsk10

alterar la pigmentación epidérmica. Por ejemplo, se considera que las mutaciones GnaqDsk1 son hiperactivas, en lugar de constitutivas, porque no se producen en aminoácidos fundamentales para la actividad GTPasa y siguen siendo dependientes de una proteína G activa acoplada al receptor de endotelina B. Véase, Van

y GnaqDsk10

Raamsdonk, C.D., et al. (2004) . De manera notable, ratones GnaqDsk1 no desarrollan tumores. Véase, Van Raamsdonk, C.D., et al. (2004) . Sin embargo, el bloqueo de la actividad GTPasa a través de la sustitución de aminoácidos críticos puede producir una activación constitutiva. Véase, Markby, D.W., et al. (1993) . Por ejemplo, una mutación de Q227 en Gas (Gnas) provoca una actividad constitutiva en tumores de pituitaria humanos. Véase, Landis, C.A., et al. (1989) , Nature 340 (6236) :692-696.

Ratones transgénicos que expresan de modo ectópico el receptor acoplado a proteína G Grm-1 en melanocitos presentan hiperpigmentación dérmica y grandes tumores melanocíticos. Véase, Pollock, P.M., et al. (2003) , Nat. Genet., 34 (1) :108-112. Además, inyecciones de células NIH3T3 transformadas con Gnaq constitutivamente activo en ratones “nude” atímicos inducen tumores en una semana después de la inyección. Véase, Kaqlinec G., et al. (1992) , Mol. Cell Biol., 12 (1010) :4687-4693.

Se ha indicado que una mutación de Gnaq estaba presente en una muestra de melanoma. Esa mutación se describe en el sitio web del Sanger Institute Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer (COSMIC) , http://www.sanger.ac.uk/cosmic. Véase, Bamford et al. (2004) , Br. J. Cancer, 91:355-358. La mutación (mutación ID nº 182000) descrita en la muestra COSMIC ID nº 753546 (nombre de la muestra CP66-MEL) es una mutación de sustitución de sentido erróneo (1075 G a A) que produce una sustitución de aminoácido conservativa (V359I) . No se indica que la mutación de sentido erróneo conservativa V369I de Gnaq en CP66-MEL tenga ningún efecto sobre la actividad Gnaq.

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que subunidades Ga activadas que surgen de mutaciones en Gnaq, por ejemplo, mutaciones que activan constitutivamente Gnaq, están presentes en neoplasmas melanocíticos, por ejemplo, nevi azules, tales como nevi de Ota, nevi azules malignos, un tipo raro de melanoma que surge de un nevus azul (véase, Granter, S.R., et al. (2001) , Am. J. Surg. Pathol., 25 (3) :316-323) ; melanomas uveales y ciertos melanomas cutáneos, por ejemplo, melanoma lentiginoso maligno o melanomas de la piel dañada por exposición crónica al sol (melanoma CSD) .

Breve sumario de la invención

La presente invención proporciona métodos para detectar una célula de melanoma o de nevus en una muestra biológica. Los métodos comprenden detectar una mutación de secuencia activadora en un gen Gnaq en una muestra biológica que incluye la célula de melanoma o célula de nevus sospechosa procedente de un paciente. Por ejemplo, la invención proporciona métodos para detectar el melanoma, por ejemplo, melanoma uveal, nevi azules malignos, o melanoma CSD (incluyendo melanoma lentiginoso maligno) , mediante la detección de la presencia de una mutación en un gen Gnaq o en un producto codificado por el gen; o mediante la detección... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar una célula de neoplasma melanocítico en una muestra biológica procedente de un paciente, comprendiendo dicho método:

detectar la presencia o la ausencia de una mutación activadora en un gen Gnaq en la muestra biológica, en el que la presencia de la mutación es indicativa de la presencia de células de neoplasma melanocítico en la muestra biológica.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la mutación es una mutación de secuencia en el codón que codifica

Gln 209 de Gnaq, opcionalmente en el que la mutación es una sustitución Q209L o Q209P. 3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa de detección comprende detectar la presencia o la ausencia de la mutación en una muestra de ácido nucleico procedente de la muestra biológica.

4. El método de la reivindicación 3, en el que:

(a) la etapa de detección comprende poner en contacto la muestra de ácido nucleico con una sonda que se hibrida de modo selectivo con el gen Gnaq, y detectar la presencia de la sonda hibridada, detectando con ello la mutación de secuencia, y opcionalmente en el que la etapa de contacto se realiza en una hibridación in situ; o

(b) la etapa de detección comprende una reacción de amplificacion, que opcionalmente comprende determinar la secuencia de la región mutada del gen Gnaq.

5. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa de detección comprende detectar la mutación en una proteína codificada por el gen.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra biológica es:

(a) una muestra de ojo, o una muestra de piel; o

(b) procede de nódulo linfático, pulmón, hígado, glándula adrenal, tejido blando, o hueso.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra biológica procede de un paciente que tiene melanoma, opcionalmente en el que el melanoma ha surgido de la úvea, un nevus azul, o piel con daños por exposición crónica al sol.

8. Un método para controlar el avance de un melanoma en un paciente sometido a una terapia, comprendiendo dicho método detectar un cambio en el número de células que tienen una mutación activadora en un gen Gnaq en una muestra biológica procedente del paciente, en el que un cambio en el número de células que tienen la mutación Gnaq es indicativo de la respuesta del paciente a la terapia.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la muestra biológica procede de:

(a) ojo, o piel; o

(b) sangre, nódulo linfático, hígado, glándula adrenal, o hueso.

10. Un antagonista de Gnaq para su uso en un método para inhibir la proliferación de células de melanoma que tienen una mutación activadora en GNAQ en un paciente que tiene melanoma, en el que el antagonista de Gnaq es un inhibidor de proteína quinasa C, un inhibidor de fosfolipasa C1, un anticuerpo contra Gnaq, o un inhibidor de ácido nucleico de Gnaq que es un ARNmc o un ARN antisentido.

11. El antagonista de Gnaq para el uso de la reivindicación 10, en el que las células de melanoma son de un melanoma uveal, surgen de un nevus azul, o son de piel con daños por exposición crónica al sól.

12. El antagonista de Gnaq para el uso de la reivindicación 10 u 11, en el que la mutación está en un codón que codifica Gln 209 de Gnaq.

13. El antagonista de Gnaq para el uso de la reivindicación 10, 11 o 12, en el que el antagonista de Gnaq es un inhibidor de ácido nucleico de Gnaq, y es un ARNmc o un ARN antisentido.

14. El antagonista de Gnaq para el uso de la reivindicación 10, 11 o 12, en el que el antagonista de Gnaq es un anticuerpo contra Gnaq.

15. El antagonista de Gnaq para el uso de la reivindicación 10, 11 o 12, en el que el antagonista de Gnaq es un inhibidor de proteína quinasa C.

16. Un método para identificar un paciente con melanoma que es un candidato para un tratamiento con un inhibidor de Gnaq, comprendiendo dicho método detectar la presencia o la ausencia de una mutación activadora en un gen Gnaq en una muestra biológica procedente de un melanoma presente en el paciente, en el que la presencia de la mutación es indicativa de un paciente con melanoma que es un candidato para un tratamiento con un inhibidor de Gnaq.

.

17. El método de la reivindicación 16, en el que:

(a) la mutación está en un codón que codifica Gln 209 de Gnaq;

(b) el melanoma es un melanoma uveal, un nevus azul maligno, o un melanoma sobre piel con daños por exposición crónica al sol; o

(c) la etapa de detección comprende detectar la mutación en una proteína codificada por el gen.

18. Un metodo para determiar el riesgo de avance de un nevus hacia un melanoma, comprendiendo dicho método detectar la presencia o la ausencia de una mutación activadora en un gen Gnaq en una muestra biológica procedente del nevus, en el que la presencia de la mutación es indicativa de un mayor riesgo de avance del nevus hacia un melanoma.

19. El método de la reivindicación 18, en el que:

(a) la mutación de secuencia es en un codón que codifica Gln 209 de Gnaq;

(b) el nevus es un nevus azul, opcionalmente en el que el nevus es un nevus de Ota; o

(c) la etapa de detección comprende detectar la mutación en una proteína codificada por el gen.