Procedimiento de multicuantificación del colesterol de lipoproteína de baja densidad.

Procedimiento para cuantificar in vitro el colesterol en la lipoproteína de baja densidad y el colesterol total enuna muestra biológica mediante una única medición que incluye una serie de tratamientos continuos hasta quese obtiene una serie de valores de medición,

y que comprende:

un primer paso de tratamiento de las lipoproteínas distintas de lipoproteínas de baja densidad en la muestrabiológica, en el que se permite que la esterasa de colesterol y la oxidasa de colesterol actúen sobrelipoproteínas distintas a la lipoproteína de baja densidad de la muestra biológica en presencia de unsurfactante derivado del óxido de polialquileno con un valor HLB de un mínimo de 13 y un máximo de 15,que actúa sobre lipoproteínas distintas de lipoproteína de baja densidad para generar peróxido dehidrógeno que no se convierte en un colorante de quinona en el primer paso y se retiene hasta un segundopaso; y

un segundo paso para convertir el peróxido de hidrógeno obtenido en el primer paso en un colorante dequinona y tratar la lipoproteína de baja densidad restante con el uso de un surfactante derivado del óxido depolialquileno, que actúa al menos sobre la lipoproteína de baja densidad y no se utiliza en el primer paso, yconvertir el peróxido de hidrógeno generado en un colorante de quinona,

caracterizado porque se permite que la esterasa de colesterol y la oxidasa de colesterol actúen sobre lalipoproteína de baja densidad de la muestra biológica en presencia de un surfactante derivado del óxido depolialquileno que actúa al menos sobre la lipoproteína de baja densidad y no se utiliza en el primer pasopara generar peróxido de hidrógeno, midiéndose el peróxido de hidrógeno generado,

y caracterizado porque se miden simultáneamente las cantidades de colesterol presentes en la lipoproteínade baja densidad y el colesterol total presentes en la muestra biológica basándose en dos valores en losque la cantidad total de cambio en la absorbancia en el segundo paso sirve como valor de medición querefleja la cantidad de colesterol total presente y la cantidad de cambio de absorbancia en relación con lacantidad de peróxido de hidrógeno generado en el segundo paso, sirve como valor de medición que reflejala cantidad de colesterol presente en la lipoproteína de baja densidad,

en el que un primer reactivo utilizado para el primer paso contiene 4-aminoantipirina o un compuestodonante de hidrógeno fenólico o anilínico, que es un compuesto reactivo que participa en la formación delcolorante de quinona, y un segundo reactivo utilizado para el segundo paso, que tiene compuestosreactivos no contenidos en el primer reactivo entre la 4-amonioantipirona, el compuesto donante dehidrógeno fenólico o anilínico y la peroxidasa, de modo que el colorante de quinona no se forma en elprimer paso, y se cuantifica el colesterol en la lipoproteína de baja densidad y el colesterol total a partir de lacantidad de colorante de quinona formado en el segundo paso, mediante una única medición que incluyeuna serie de tratamientos continuos hasta que se obtiene una serie de valores de medición.

Procedimiento de multicuantificación del colesterol de lipoproteína de baja densidad

Campo Técnico La presente invención se refiere a un procedimiento para medir simultáneamente el colesterol de la lipoproteína y el colesterol total como análisis en muestras biológicas, y en particular a un procedimiento que hace posible estabilizar reactivos líquidos utilizados para la medición.

Técnica Anterior

La lipoproteína de baja densidad (denominada aquí en adelante “LDL”) juega un papel principal en el transporte del colesterol en la sangre y, en particular, el colesterol depositado en las paredes de los vasos sanguíneos en la arterioesclerosis se deriva principalmente de la LDL. Un aumento en el colesterol LDL es uno de los principales factores de riesgo de las enfermedades arterioescleróticas, y su medición selectiva es clínicamente útil. La medición del colesterol total incluye la medición del colesterol en todas las lipoproteínas, tales como los quilomicrones (CM) , la lipoproteína de muy baja densidad (VLDL) , LDL, y la lipoproteína de alta densidad (HDL) , y es aún un elemento principal de la prueba de lípidos.

Los procedimientos habituales para medir el colesterol LDL incluyen un procedimiento de medición a partir de dos operaciones de fraccionamiento y determinación del colesterol y un procedimiento de medición mediante el cálculo basado en los valores del colesterol total, HDL, colesterol, y triglicéridos, según la ecuación de Friedewald.

Para el fraccionamiento, existen procedimientos tales como el ultracentrifugado, la precipitación, y la técnica inmunológica. Estos procedimientos requieren un proceso de tratamiento de una muestra mediante el ultracentrifugado o filtrado, y ha sido difícil su uso generalizado en las instalaciones de ensayos de laboratorio debido a su conveniencia y rentabilidad. El procedimiento de cálculo basado en la ecuación Friedwald tiene un uso limitado, y va asociado a problemas de exactitud debido a que no tienen en cuenta las diferencias individuales.

Recientemente se ha informado un procedimiento de medición del colesterol LDL que no requiere el fraccionamiento (Publicación de Patente JP (Kokai) número 11-318496 A (1999) ) , y actualmente se está utilizando en instalaciones de ensayo como reactivo de ensayo de laboratorio. Este procedimiento comprende un primer paso en el cual se elimina selectivamente en una muestra el colesterol en las lipoproteínas distintas a LDL (“eliminado” significa que se degrada el colesterol tipo éster y el producto de degradación se hace indetectable en un segundo paso) , y un segundo paso en el cual se mide el colesterol LDL.

A pesar del hecho de que el reactivo para la medición de colesterol LDL descrito anteriormente es un reactivo útil clínicamente, la medición habitual del colesterol total se realiza muy a menudo, y el reactivo no ha pasado a tener un amplio uso debido a que los niveles de colesterol LDL pueden determinarse utilizándose la ecuación Friedwald, etc. No obstante, existe un problema en los niveles de colesterol LDL determinados por la ecuación Friedewald tal como se describe anteriormente, y la medición exacta de los niveles de colesterol es clínicamente importante. Así pues, se ha deseado mejorar aún más el reactivo, permitiendo de ese modo que se utilice habitualmente el reactivo para la medición del colesterol LDL de elevada importancia clínica.

Por otro lado, se describió un procedimiento en el cual se miden secuencialmente mediante una única medición el colesterol HDL y el colesterol total, así como el colesterol LDL y el colesterol total (Publicación de Patente JP 2003501630 A) . En este procedimiento, se coloca en un tubo una muestra, permitiendo que forme un complejo entre el colesterol no HDL de la muestra y un anticuerpo anti-apoB, midiéndose la lipoproteína en la forma no complexada, concretamente, HDL. Después de disocia el complejo con un surfactante, y se mide enzimáticamente el colesterol no HDL restante. Sumando los dos valores de medición, se encuentra el nivel de colesterol total. En el caso del colesterol LDL, se utiliza un procedimiento similar de reacción, en el cual se usa un anticuerpo anti-apoA-I o anti-apoA-II, en lugar del anticuerpo anti-apoB en el momento de formación del complejo. El colesterol HDL, colesterol LDL y el colesterol total se suelen medir normalmente en revisiones médicas y similares, y ha sido importante la medición simultánea del colesterol HDL, colesterol LDL y colesterol total.

Descripción de la invención El objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento de estabilización para eliminar el desarrollo espontáneo del color de un reactivo que hace posible medir simultáneamente el colesterol LDL y el colesterol total en una única medición. Este procedimiento es útil como procedimiento múltiple de medición en el cual pueden obtenerse los valores cuantificados de una serie de elementos en una única medición.

A la luz de la importancia que ha tomado recientemente la medición exacta del colesterol LDL, y la importancia conocida habitualmente de la medición del colesterol total, los inventores de la presente estudiaron diligentemente para establecer un sistema de medición simultánea del colesterol LDL y el colesterol total.

Los inventores de la presente desarrollaron previamente un procedimiento capaz de medir simultáneamente el colesterol LDL y el colesterol total (Solicitud de Patente Japonesa número 2002-362970, WO 2004/055204) . Este procedimiento comprende permitir que la esterasa de colesterol y la oxidasa de colesterol actúen sobre las lipoproteínas en presencia de un surfactante que actúe sobre lipoproteínas distintas a LDL, midiéndose el colesterol de las lipoproteínas distintas a LDL, convertir el peróxido de hidrógeno generado en un colorante de quinona, añadir posteriormente un surfactante que actúa al menos sobre la LDL, permitir que la esterasa de colesterol y la oxidasa de colesterol actúen sobre la LDL restante y medir el colesterol LDL, convirtiendo el peróxido de hidrógeno generado en colorante de quinona, donde puede calcularse el valor de colesterol total sumándose los dos valores de medición anteriores. Este procedimiento fue efectivo como procedimiento de medición múltiple en el cual pueden obtenerse en una única medición los valores cuantificados de una serie de elementos. No obstante, en este procedimiento los componentes para producir el colorante de quinona están presentes en un primer reactivo en un estado de reactivo líquido para su uso y, en consecuencia, el reactivo se oxida con el aire, provocando un problema de desarrollo espontáneo de color, por lo cual carece de estabilidad como reactivo líquido.

Así pues, los inventores de la presente estudiaron diligentemente la estabilización del reactivo que hace posible medir simultáneamente el colesterol LDL y el colesterol total en una única medición, y encontraron un procedimiento en el cual el colesterol LDL y el colesterol total se miden con exactitud suprimiéndose el desarrollo espontáneo de color en el reactivo para su uso en un procedimiento de medición simultánea del colesterol LDL y el colesterol total, en una única medición.

En el procedimiento anterior de medición, los procedimientos de la reacción enzimática de colesterol en lipoproteínas distintas a LDL en una muestra para la detección del colesterol se efectuaban en el primer paso. No obstante, en el presente procedimiento de medición según la reivindicación 1 se mejoraron los procedimientos a fin de permitir la detección de la reacción enzimática del colesterol en las lipoproteínas distintas a LDL, que tiene lugar en el primer paso, en una etapa temprana del segundo paso, y la detección de la reacción enzimática del colesterol LDL después de las siguientes etapas.

La Figura 1 describe el principio de la invención. Tal como se ilustra en la Figura 1, el procedimiento de la presente invención comprende dos pasos. En el primer paso, en una muestra se genera el peróxido de hidrógeno mediante una reacción basada en el colesterol de lipoproteínas distintas a LDL. En el segundo paso, tiene lugar un cambio en la absorbancia de la solución de la reacción debido al peróxido de hidrógeno generado en el primer paso, ocurriendo posteriormente una reacción basada en el colesterol en la LDL, y se mide el cambio en la absorbancia de la solución de reacción debido a dicha reacción. La cantidad del cambio total en la absorbancia en el segundo paso corresponde al colesterol total, y la cantidad de cambio en la absorbancia en relación con la cantidad de peróxido de hidrógeno generado en el segundo paso corresponde a la cantidad de colesterol LDL. Cambiando las condiciones analísticas... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para cuantificar in vitro el colesterol en la lipoproteína de baja densidad y el colesterol total en una muestra biológica mediante una única medición que incluye una serie de tratamientos continuos hasta que se obtiene una serie de valores de medición, y que comprende:

un primer paso de tratamiento de las lipoproteínas distintas de lipoproteínas de baja densidad en la muestra biológica, en el que se permite que la esterasa de colesterol y la oxidasa de colesterol actúen sobre lipoproteínas distintas a la lipoproteína de baja densidad de la muestra biológica en presencia de un surfactante derivado del óxido de polialquileno con un valor HLB de un mínimo de 13 y un máximo de 15, que actúa sobre lipoproteínas distintas de lipoproteína de baja densidad para generar peróxido de hidrógeno que no se convierte en un colorante de quinona en el primer paso y se retiene hasta un segundo paso; y un segundo paso para convertir el peróxido de hidrógeno obtenido en el primer paso en un colorante de quinona y tratar la lipoproteína de baja densidad restante con el uso de un surfactante derivado del óxido de polialquileno, que actúa al menos sobre la lipoproteína de baja densidad y no se utiliza en el primer paso, y convertir el peróxido de hidrógeno generado en un colorante de quinona, caracterizado porque se permite que la esterasa de colesterol y la oxidasa de colesterol actúen sobre la lipoproteína de baja densidad de la muestra biológica en presencia de un surfactante derivado del óxido de polialquileno que actúa al menos sobre la lipoproteína de baja densidad y no se utiliza en el primer paso para generar peróxido de hidrógeno, midiéndose el peróxido de hidrógeno generado, y caracterizado porque se miden simultáneamente las cantidades de colesterol presentes en la lipoproteína de baja densidad y el colesterol total presentes en la muestra biológica basándose en dos valores en los que la cantidad total de cambio en la absorbancia en el segundo paso sirve como valor de medición que refleja la cantidad de colesterol total presente y la cantidad de cambio de absorbancia en relación con la cantidad de peróxido de hidrógeno generado en el segundo paso, sirve como valor de medición que refleja la cantidad de colesterol presente en la lipoproteína de baja densidad, en el que un primer reactivo utilizado para el primer paso contiene 4-aminoantipirina o un compuesto donante de hidrógeno fenólico o anilínico, que es un compuesto reactivo que participa en la formación del colorante de quinona, y un segundo reactivo utilizado para el segundo paso, que tiene compuestos reactivos no contenidos en el primer reactivo entre la 4-amonioantipirona, el compuesto donante de hidrógeno fenólico o anilínico y la peroxidasa, de modo que el colorante de quinona no se forma en el primer paso, y se cuantifica el colesterol en la lipoproteína de baja densidad y el colesterol total a partir de la cantidad de colorante de quinona formado en el segundo paso, mediante una única medición que incluye una serie de tratamientos continuos hasta que se obtiene una serie de valores de medición.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el cambio en la absorbancia del segundo paso muestra un aumento bifásico en el cual existe un rápido aumento después de añadir un segundo reactivo y un aumento moderado posterior; y se mide el colesterol en la lipoproteína de baja densidad a partir de la cantidad del último cambio moderado en la absorbancia.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque se mide el colesterol total a partir de la cantidad total de cambio en la absorbancia del segundo paso.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el análisis se efectúa mediante una única medición que incluye una serie de tratamientos continuos hasta que se obtiene una serie de valores de medición según diferentes condiciones de medición, utilizándose un analizador automático para el ensayo químico clínico.