MÉTODO DE ANÁLISIS DE ANTÍGENO Y REACTIVO PARA EL MISMO.

Procedimiento para medir un antígeno de ensayo mediante aglutinación de látex usando partículas de látex sensibilizadas,

comprendiendo dicho procedimiento: hacer reaccionar partículas de látex sensibilizadas suspendidas en un tampón con dicho antígeno de ensayo; siendo dichas partículas de látex sensibilizadas dos tipos de partículas grandes y pequeñas, que tienen diferentes tamaños medios de partícula, sensibilizándose cada una de dichas partículas de látex con el mismo anticuerpo o el mismo fragmento de unión a antígeno del mismo, cuyo anticuerpo se somete a una reacción antígeno-anticuerpo con dicho antígeno de ensayo; teniendo dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, inmovilizado sobre dichas partículas de látex, una pureza no inferior al 14% en peso basado sobre la cantidad total de proteínas transportadas sobre dichas partículas; siendo la cantidad de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, inmovilizado por una partícula de dichas partículas pequeñas, del 0,5 al 10% en peso de la cantidad de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inmovilizado por una partícula de dichas partículas grandes; teniendo dichas partículas de látex grandes un tamaño medio de partícula de 0,15 a 0,29 μm; teniendo dichas partículas de látex pequeñas un tamaño medio de partícula de 0,05 μm a 0,10 μm; siendo la concentración de dichas partículas de látex grandes en el sistema de reacción antígeno-anticuerpo del 0,01 al 0,04% p/v; siendo la concentración de dichas partículas de látex pequeñas en el sistema de reacción antígeno-anticuerpo del 0,05 a 0,2% p/v; y medir ópticamente la aglutinación de dichas partículas de látex sensibilizadas

Campo Técnico

[0001]La presente invención está relacionada con un método para medir un antígeno mediante un método de aglutinación por látex y un reactivo para ello.

Antecedentes de la Técnica [0002]Los inmunoensayos que utilizan partículas de látex se aplican a ensayos clínicos para cuantificar sustancias antigénicas contenidas en los fluidos corporales tales como suero, plasma sanguíneo y orina. Se usan ampliamente ya que permiten realizar mediciones rápidas y simples usando analizadores automáticos. [0003]En los últimos años, se propusieron técnicas aplicadas destinadas a promover más el rendimiento de la medición. Por ejemplo, por el reactivo empleando dos tipos de partículas de látex que tienen diferente tamaño promedio de partícula sobre el que se inmoviliza el mismo anticuerpo en al menos dos cantidades diferentes (Bibliografía de Patente 1) o por el método de medición usando dos o más tipos de partículas de látex que tienen diferente tamaño promedio de partícula, sensibilizadas con un anticuerpo (Bibliografía de Patente 2), pueden obtenerse mediciones en un amplio intervalo. Puede obtenerse el mismo efecto, por el método en el cual un anticuerpo policlonal y un anticuerpo monoclonal se inmovilizan sobre partículas transportadoras insolubles que tienen un sólo tamaño promedio de partícula (Bibliografía de Patente 3). Además, se han propuesto métodos de medición en los que se usan partículas que tienen un pequeño tamaño de partícula recubiertas con un anticuerpo con una baja reactividad y partículas que tienen un gran tamaño de partícula recubiertas con un anticuerpo con una elevada reactividad (Bibliografía de Patente 4 y 5). Aún más, la Bibliografía 1 y 2, que no es de patente, describe inmunoensayos por métodos de aglutinación, que usan partículas sensibilizadas mezcladas usando dos tipos de partículas transportadoras grandes y pequeñas, en el que un anticuerpo monoclonal que tiene una baja tasa de reacción se inmoviliza sobre las partículas transportadoras que tienen un menor tamaño promedio de partícula y un anticuerpo monoclonal que tiene una alta tasa de reacción se inmoviliza sobre las partículas transportadoras que tienen un mayor tamaño promedio de partícula. [0004]Sin embargo, los métodos descritos en estas bibliografías tienen el inconveniente de que el intervalo de concentración en el que se consigue la medición es estrecho y la medición en la región de alta concentración es difícil.

Bibliografía de Patente 1: Publicación de Patente Japonesa (Kokoku) Nº 63

14783 Bibliografía de Patente 2: Publicación de Patente Japonesa Nº 2588174 Bibliografía de Patente 3: Solicitud de Patente Japonesa abierta a

Inspección Pública (Kokai) Nº 10-90268 Bibliografía de Patente 4: Solicitud de Patente Japonesa abierta a

Inspección Pública (Kokai) Nº 11-108929 Bibliografía de Patente 5: Publicación de Patente Japonesa (Kokai) Nº

3513075 Bibliografía no de Patente 1: Journal of Clinical laboratory Analysis 12:137

144 (1988) Bibliografía no de Patente 2: Japanese Journal of Medicine and

Pharmaceutical

Science, 42(5):781-788, 1999 [0005]Sánchez A. et al. (2002) Clin. 48, nº 5-6, páginas 313-317, evalúan el resultado analítico de un método inmunoturbidimétrico de la CRP en un analizador COBAS Integra 400. [0006]Eda S. et al. (1999) Scand. J. Clin. Lab. Invest., vol. 230, páginas 3235 describen un método basado en turbidimetría potenciado con micropartículas y su uso para medir la proteína C reactiva (CRP). El método emplea una mezcla de dos tipos de reactivos de micropartículas que difieren en el tamaño de las micropartículas y en la reactividad del anticuerpo recubierto. [0007]El documento EP 0 898 169 está relacionado con un ensayo de aglutinación por dispersión de luz potenciado con micropartículas para determinar la cantidad de un analito, y un reactivo usado en el ensayo. El ensayo usa una mezcla de partículas de fuertes propiedades de dispersión de luz que transportan al menos un compañero de unión de alta reactividad para el analito y partículas de débiles propiedades de dispersión de luz que transportan al menos un compañero de unión de baja reactividad para el analito. [0008]El documento US 2001/026945 describe reactivos y el uso de reactivos en un ensayo de aglutinación por dispersión de luz con micropartículas. Los reactivos comprenden una mezcla de partículas que tienen propiedades de dispersión de luz relativamente más fuertes y partículas que tienen propiedades de dispersión de luz relativamente débiles con respecto a las demás. Las partículas que tienen propiedades de dispersión de luz fuertes transportan un compañero de unión de alta reactividad con el analito. Las partículas que tienen propiedades de dispersión de luz débiles transportan un compañero de unión de baja reactividad con el analito. [0009]Eda S. et al. (1998) J. Clin. Lab. Anal. vol. 12, nº 3, páginas 137-144, describen un ensayo basado en micropartículas para la proteína C reactiva. Este ensayo usa micropartículas de dos tamaños diferentes recubiertas covalentemente con dos anticuerpos monoclonales de diferente reactividad. [0010]Katano S. (1999) Igaku a Yakugaku J. Med., vol. 42, nº 5, páginas 781788 describe un ensayo de la proteína sérica mediante el analizador químico-clínico COBAS Integra 400 totalmente automatizado. El ensayo usa micropartículas de dos tamaños diferentes recubiertas covalentemente con dos anticuerpos monoclonales de diferente reactividad. [0011]Benecky M. et al. (1997), Clin. Chem., Vol. 43, nº 9, páginas 1764-1770 describen un método de dispersión de luz con partículas acoplados para determinar la presencia de analitos múltiples en un medio. Usando mezclas de micropartículas de látex de diferente tamaño se configuran ensayos múltiples simultáneos. [0012]Tarkkinen P. et al. (2002), Clin. Chem. vol. 48, nº 12, páginas 269-277, describen un inmunoensayo cinético, no competitivo, para la CRP que usa micropartículas porosas, recubiertas covalentemente con un anticuerpo de captura monoclonal. Las micropartículas usadas eran micropartículas porosas de acrilato de 60 m. [0013]Holownia P. et al. (2001), Anal. Chem., vol. 73, nº 14, páginas 34263431, describen el efecto del poli(etilenglicol) y otros tensioactivos para la realización de un inmunoensayo de la CRP con partículas de látex. Cada ensayo emplea un sólo tamaño de micropartículas de látex.

[0014]Pérez-Amodio S. et al. (2001), Anal. Chem., vol. 73, nº 14, páginas 3417-3425 describen el efecto del medio iónico, carga y química de la superficie de partícula en un inmunoensayo de la CRP con partículas de látex. Cada ensayo emplea un sólo tamaño de micropartículas de látex. [0015]Peula J. M. et al. (1995), J. Biomaterials Sci. Vol. 7, nº 3, páginas 241251, describen la estabilidad coloidal y la inmunoreactividad de partículas de látex recubiertas con BSA monomérica o un anticuerpo anti-CRP. Se describen condiciones de incubación que producen partículas de látex con estabilidad coloidal y reactividad elevadas. [0016]SERADYN INC., 1 de septiembre del 2005, páginas 1-7 describe la fabricación y las propiedades del poliestireno y de micropartículas modificadas con carboxilato. [0017]Griffen C. et al. 1994 "Microparticle reagent optimization" 1994, (SERADYN INC.) es un manual de laboratorio de referencia que describe las propiedades de reactivos de micropartículas, junto con métodos para su preparación y uso. [0018]Borque et al. (2000), Clin. Chem. vol. 46, nº 11, páginas 1839-1842 describen el desarrollo y la validación de un ensayo inmunoturbidimétrico ultrasensible y automatizado para la proteína C reactiva. En cada ensayo, se usó un sólo tamaño de micropartícula. [0019]Kondo et al. (1991), Biotech. y Bioeng. vol. 37, páginas 537-543 describen los efectos de las propiedades de la superficie de las partículas sobre la adsorción de proteínas sobre la partícula. [0020]Giacomelli et al. (2000), J. Colloid and Interface Sci. vol.231, páginas 283-288, describen el comportamiento de la adsorción de un anticuerpo monoclonal (inmunoglobulina G) sobre partículas de látex que tienen grupos clorometil pre-recubiertos con "Chaps".

Descripción de la invención Problemas que la invención intenta resolver [0021]En muchos de los elementos de inspección ensayados en los ensayos inmunoserológicos clínicos el punto importante para emitir un juicio clínico es el intervalo de baja concentración. Por lo tanto, es evidente que la precisión de la medición del intervalo de baja concentración afecta en gran...

1. Procedimiento para medir un antígeno de ensayo mediante aglutinación de látex usando partículas de látex sensibilizadas, comprendiendo dicho procedimiento:

hacer reaccionar partículas de látex sensibilizadas suspendidas en un tampón con dicho antígeno de ensayo; siendo dichas partículas de látex sensibilizadas dos tipos de partículas grandes y pequeñas, que tienen diferentes tamaños medios de partícula, sensibilizándose cada una de dichas partículas de látex con el mismo anticuerpo o el mismo fragmento de unión a antígeno del mismo, cuyo anticuerpo se somete a una reacción antígeno-anticuerpo con dicho antígeno de ensayo; teniendo dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, inmovilizado sobre dichas partículas de látex, una pureza no inferior al 14% en peso basado sobre la cantidad total de proteínas transportadas sobre dichas partículas; siendo la cantidad de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, inmovilizado por una partícula de dichas partículas pequeñas, del 0,5 al 10% en peso de la cantidad de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inmovilizado por una partícula de dichas partículas grandes; teniendo dichas partículas de látex grandes un tamaño medio de partícula de 0,15 a 0,29 m; teniendo dichas partículas de látex pequeñas un tamaño medio de partícula de 0,05 m a 0,10 m; siendo la concentración de dichas partículas de látex grandes en el sistema de reacción antígeno-anticuerpo del 0,01 al 0,04% p/v; siendo la concentración de dichas partículas de látex pequeñas en el sistema de reacción antígeno-anticuerpo del 0,05 a 0,2% p/v; y medir ópticamente la aglutinación de dichas partículas de látex sensibilizadas.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se inmoviliza sobre dicha partícula de látex grande en una cantidad del 85% al 120% de la cantidad de adsorción máxima sobre una línea isoterma de adsorción del 100%.