MODELO ORGANOTIPICO DE ENFERMEDADES NEURO-DEGENERATIVAS, PROCESO DE OBTENCION Y USOS DEL MISMO.

Modelo organotípico de enfermedades neuro-degenerativas, proceso de obtención y usos del mismo.

La presente invención se relaciona con un modelo organotípico de enfermedades neurodegenerativas así como un método para la obtención de dicho cultivo organotípico. La presente invención también se refiere a los usos de dicho modelo para el rastreo de compuestos farmacológicamente activos.

Modelo organotípico de enfermedades neuro-degenerativas, proceso de obtención y usos del mismo.

Campo técnico de la invención

La invención se encuadra, en general, dentro del sector de las enfermedades neurodegenerativas; más concretamente, en el desarrollo de modelos organotípicos tridimensionales de enfermedades neurodegenerativas.

Antecedentes de la invención

Enfermedad de Parkinson

La enfermedad de Parkinson (PD, del inglés “Parkinson Disease”) es una enfermedad neurodegenerativa crónica y progresiva que lleva consigo problemas de control del movimiento, tremor, rigidez, bradiquinesia en todo tipo de movimientos como al andar, estar sentado, comer, hablar etc., así como inestabilidad postural. La etiología de la PD aún no ha sido completamente esclarecida, pero los síntomas están claramente asociados a la degeneración selectiva de las neuronas dopaminérgicas en la substantia nigra. El déficit dopaminérgico en la vía nigroestriatal induce una consiguiente pérdida de neuronas estriatales ocasionando una variedad de cambios citológicos que incluyen la agregación de alfa-sinucleina en los denominados cuerpos de Lewy.

Las estrategias actualmente utilizadas para restaurar el sistema dopaminérgico son de naturaleza farmacológica, como la administración de levodopa (1-DOPA) , o bien de naturaleza restaurativa como el injerto de células madre. Recientemente, se ha identificado células madre endógenas en regiones neurogénicas del cerebro adulto; en particular, en la zona subventricular, se piensa que se encuentra el mayor nicho neurogénico con potencial para generar neuronas en áreas primariamente no neurogénicas, como la zona del cerebro medio y el estriatum (Arias-Carrión, O. et al., 2007. CNS Neurol Disord Drug Targets. 6, 326-335) . La modulación de la neurogénesis representa, por tanto, una línea de terapia interesante ya que se trata de un tratamiento no invasivo que conlleva el replazamiento neuronal autólogo.

Modelos para el estudio de la enfermedad de Parkinson (PD)

Existen diferentes modelos que han sido utilizados en los últimos años para estudiar la PD. Un modelo bien establecido de PD es el modelo de rata 6-hidroxi-dopamina (6-OHDA) . En dicho modelo, 6-OHDA es administrado estereotáxicamente en el cerebro induciendo una degeneración selectiva de las neuronas dopaminérgicas comparable a la observada en pacientes con PD. 6-OHDA usa el mismo mecanismo de transporte intracelular que la dopamina y la noradrenalina llevando a una muerte celular mediada por estrés oxidativo. Otro modelo utilizado para el estudio de los procesos degenerativos de la enfermedad así como para el estudio de nuevas drogas y terapias para PD, es la inyección de 1-metil-4-fenil-1, 2, 3, 6-tetrahidropiridina (MPTP) en el cerebro de monos o ratones (Jackson-Lewis, et al 2007 Nature Protocols. 2, 141-151) . Este modelo también imita las características de la enfermedad de PD ya que el compuesto MPTP es transportado de manera selectiva a las neuronas de la substantia nigra y allí es convertido intracelularmente en un metabolito altamente reactivo (1-metil-4-fenilpiridino (MPP+) ) que provoca el bloqueo del complejo I mitocondrial causando así muerte neuronal.

Por otro lado, se ha utilizado modelos in vitro para el estudio de la PD. Sin embargo, el valor de los modelos in vitro con respecto a la recapitulación de las características de la PD es menos clara. El uso de cultivos celulares tales como el cultivo de líneas celulares de células mesecefálicas primarias o de líneas celulares derivadas de neuronas dopaminérgicas (e.g., células SH-SY5Y humanas y PC12 de rata) se ha utilizado para estudiar el mecanismo de degeneración dopaminérgica. En dichas células se aplican de manera crónica drogas que afectan complejos mitocondriales lo que lleva consigo la generación de especies de oxígeno reactivas. Sin embargo, todos los modelos celulares in vitro usan tipos celulares sustitutivos por lo que la relevancia con la PD humana es reducida (Shimohama et al., 2003 Trends in Molecular Medicine. 9, 360-365) .

Por otro lado, se han utilizado cultivos organotípicos obtenidos de diferentes regiones del sistema nervioso central (SNC) para el estudio de diferentes enfermedades neurodegenerativas (Cavaliere, F. et al, 2006 Exp Neurol. 201, 6674; Noraberg, J. et al; 1999 Brain Res Brain Res Protoc. 3, 278-290 y Gogolla, N. et al; 2006 Nature Protocols. 1, 1165-1171) .

Estos modelos tienen mayores similitudes con la situación in vivo ya que se mantienen tanto la estructura organotípica de la zona como las interacciones célula-célula naturales. Además, estos cultivos permiten la realización de experimentos de electrofisiología así como análisis de inmunofluorescencia.

Un ejemplo de modelo de cultivo organotípico para el estudio de las interacciones del córtex y el striatum con la substantia nigra, es el modelo de co-cultivo de córtex y el striatum con la substantia nigra desarrollado por Plenz and Kitai (1996 Neurosci Lett. 209, 177-80) . En dicho modelo, se han dispuesto diferentes cultivos organotípicos de diferentes regiones del cerebro, lo que lleva consigo la desventaja de que la vía nigroestriatal original sufre una remodelación en cultivo excluyéndose además parte del circuito.

La solicitud de patente WO 06/047299 describe un modelo organotípico para el estudio de la PD. En dicho modelo se realiza la disección de diversas regiones del cerebro que son posteriormente cultivadas y tratadas con 6-OHDA para provocar una degeneración neuronal así como una denervación de la ruta nigroestriatal.

Sin embargo, a la hora de realizar estudios de rastreo (screening) de nuevas drogas así como de testado de drogas ya existentes, el uso de modelos de PD que lleven consigo la adición de productos químicos presenta diversas desventajas. Por un lado, la presencia en el cultivo de compuestos químicos puede interferir con el mecanismo de acción de las moléculas testadas. Por otro lado, puesto que todavía no ha sido demostrado si los oligodendrocitos y la mielina de las fibras neuronales de la substantia nigra pueden afectar la captación in vitro de compuestos químicos, los compuestos químicos utilizados en dichos modelos para realizar la lesión podrían interferir con la función de las células gliales.

Por ello, uno de los objetivos principales que persigue la investigación en este campo es el desarrollar métodos que permitan estudiar los mecanismos neurodegenerativos de la PD y que permitan realizar el screening de drogas y el testado de drogas sin usar productos químicos.

Compendio de la invención

Ahora, los inventores han observado que la generación de una lesión mecánica en cultivos organotípicos tridimensionales que mantienen intacta las conexiones nigroestriatales entre la substantia nigra y el estriatum, provoca una degeneración dopaminérgica similar a la encontrada en los pacientes con PD, sin la necesidad de tener que utilizar drogas o sustancias químicas.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener un cultivo organotípico de una porción de cerebro de un animal no humano que comprende las zonas substantia nigra, striatum, córtex y zona subventricular, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) diseccionar el cerebro de dicho animal no humano, seleccionar una porción de dicho cerebro que comprende dichas zonas substantia nigra, striatum, córtex y zona subventricular y que, además, mantiene intacta la vía de señalización nigro-estriatal, y mantener dicha porción de cerebro en las condiciones adecuadas para su supervivencia;

b) transferir dicha porción de cerebro a un soporte que permite la captación de oxígeno y nutrientes por dicha porción de cerebro;

c) mantener dicha porción de cerebro bajo condiciones que garantizan la supervivencia celular del mismo; y

d) generar en dicha porción de cerebro una lesión mecánica de las vías de señalización nigro-estriatales que conduce a una denervación de dichas vías de señalización.

El cultivo organotípico tridimensional obtenible según dicho método constituye un aspecto adicional de esta invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de dicho cultivo organotípico tridimensional como modelo para el estudio de una enfermedad neurodegenerativa o como modelo para el estudio de la denervación dopaminérgica.... [Seguir leyendo]

1. Un método para obtener un cultivo organotípico de una porción de cerebro de un animal no humano que comprende las zonas substantia nigra, striatum, córtex y zona subventricular, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) diseccionar el cerebro de dicho animal no humano, seleccionar una porción de dicho cerebro que comprende dichas zonas substantia nigra, striatum, córtex y zona subventricular y que, además, mantiene intacta la vía de señalización nigro-estriatal, y mantener dicha porción de cerebro en las condiciones adecuadas para su supervivencia;

b) transferir dicha porción de cerebro a un soporte que permite la captación de oxígeno y nutrientes por dicha porción de cerebro;

c) mantener dicha porción de cerebro bajo condiciones que garantizan la supervivencia celular del mismo; y

d) generar en dicha porción de cerebro una lesión mecánica de las vías de señalización nigro-estriatales que conduce a una denervación de dichas vías de señalización.

2. Método según la reivindicación 1, en el que en la etapa d) se genera una lesión mecánica de las vías de señalización nigro-estriatales-corticales.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones1ó2, enelque el animal no-humano es un roedor.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la disección en la etapa a) se realiza de manera que la porción de cerebro seleccionada comprende una porción dorso-ventral.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la porción de cerebro seleccionada tiene un espesor comprendido entre 100 micrómetros y 500 micrómetros, preferentemente, entre 300 y 400 micrómetros.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la lesión mecánica generada en la etapa d) se realiza por medio de un corte entre el caudate putamen yla substantia nigra.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende, además, la determinación de la viabilidad del cultivo.

8. Método según la reivindicación 7, en el que la viabilidad del cultivo se determina mediante un método seleccionado entre inspección visual bajo microscopio, un inmunoensayo utilizando colorantes vitales, la cuantificación de la agregación de alfa-sinucleina, la cuantificación de neuronas positivas a tirosina hidrolasa, la secreción de dopamina o neurotransmisores, o combinaciones de los mismos.

9. Un cultivo organotípico tridimensional obtenible mediante un método como el definido en cualquiera de las reivindicaciones1a8.

10. Uso de un cultivo organotípico tridimensional según la reivindicación 9, como modelo para el estudio de una enfermedad neurodegenerativa.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad neurodegenerativa debida a un mal funcionamiento de las vías nigro-estriatal o cortico-estriatal.

12. Uso según la reivindicación 10, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es la Enfermedad de Parkinson.

13. Uso de un cultivo organotípico tridimensional según la reivindicación 9, como modelo para el estudio de la denervación dopaminérgica.

14. Un método para el estudio de una enfermedad neurodegenerativa o de la denervación dopaminérgica que comprende el empleo como modelo de un cultivo organotípico tridimensional según la reivindicación 9.

15. Método según la reivindicación 14, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad neurodegenerativa debida a un mal funcionamiento de las vías nigro-estriatal o cortico-estriatal.

16. Método según la reivindicación 14, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es la Enfermedad de Parkinson.

17. Un método de rastreo para identificar compuestos potencialmente útiles para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas que comprende:

a) poner en contacto un cultivo organotípico según la reivindicación 9 con el compuesto a ensayar; y

b) analizar la viabilidad celular del cultivo,

en donde un compuesto se considera que es potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas cuando dicho cultivo organotípico permanece viable tras el tratamiento con dicho compuesto.

18. Método según la reivindicación 17, que comprende, además, la realización de una etapa c) adicional en la que se analiza la viabilidad de un cultivo control, y el compuesto se considera que es potencialmente útil para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas cuando dicho cultivo organotípico tratado con dicho compuesto permanece igual

o más viable que el cultivo control.

19. Un método de rastreo para identificar identificar compuestos potencialmente útiles para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas que comprende poner en contacto un cultivo organotípico tridimensional según la reivindicación 9 con el compuesto a ensayar, y seleccionar aquellos compuestos que disminuyen la degeneración dopaminérgica, o que disminuyen el daño neuronal, o que inducen neurogénesis o que producen regeneración neuronal en dicho cultivo organotípico tratado con el compuesto a ensayar en comparación con un cultivo control.

20. Método según la reivindicación 19, en el que, adicionalmente, se mide la viabilidad del cultivo organotípico tridimensional según la reivindicación 9 después de la administración del compuesto a ensayar y la viabilidad del cultivo control, y se seleccionan aquellos compuestos que no disminuyen la viabilidad del cultivo control.