Composición que comprende moléculas de eritropoyetina recombinantes que comprenden glicanos N-unidos,

caracterizada porque el número promedio de estructuras de lewis-X en glicanos N-unidos por molécula de eritropoyetina es al menos de 2, 7.

Métodos y medios para producir proteínas con modificaciones postraduccionales predeterminadas

5 Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la tecnología de ADN recombinante. La invención se refiere además a la producción de proteínas. Más particularmente, la presente invención se refiere a la producción de proteínas recombinantes para su uso como constituyente terapéuticamente activo de una preparación farmacéutica. La solicitud también se refiere a líneas celulares de mamíferos, identificadas, seleccionadas y/o creadas para la producción recombinante de proteínas. La invención se refiere además al uso de proteínas así producidas.

Antecedentes de la invención

Se conocen sistemas de expresión celulares recombinantes para la producción de proteínas. Estos sistemas varían desde bacterias, levaduras y hongos hasta células vegetales, desde células de insectos hasta células de mamíferos. La elección del huésped de producción y el sistema de expresión depende generalmente de consideraciones tales como la facilidad de uso, el coste de cultivo, las características de crecimiento, los niveles de producción y la capacidad para crecer en medio libre de suero. Se sabe que los sistemas de expresión celulares mencionados anteriormente también difieren en la capacidad para ejercer modificaciones cotraduccionales y postraduccionales tales como plegamiento, fosforilación, γ-carboxilación y γ-hidroxilación. A pesar del reconocimiento de que la elección del sistema de expresión recombinante puede tener drásticas consecuencias sobre la estructura final de las proteínas expresadas, las modificaciones postraduccionales no han desempeñado en general un papel decisivo en la selección de un sistema de expresión adecuado para una proteína dada.

En los últimos varios años, los estudios han revelado más sobre las complejidades de modificaciones postraduccionales diferenciales de proteínas humanas y las posibles implicaciones en funciones en el cuerpo humano. Por ejemplo, hallazgos relativamente recientes sugieren que patrones de glicosilación diferencial de proteínas humanas que se producen en la sangre (las denominadas modificaciones "de tipo sérico") son diferentes de las que se producen en el líquido cefalorraquídeo en el cerebro (modificaciones "de tipo cerebral") . Esta diferencia puede ser una cuestión clave que es de importancia primordial para el diseño de agentes terapéuticos eficaces.

En general, las glicoproteínas neurales humanas se caracterizan por su glicosilación, que se ha denominado en la bibliografía glicosilación de "tipo cerebral" (Margolis y Margolis 1989; Hoffmann et al. 1994) . En contraposición a proteínas glicosiladas "de tipo sérico" (es decir, glicoproteínas que circulan en la sangre) , las proteínas glicosiladas de tipo cerebral presentan de manera característica azúcares N-unidos de tipo complejo que se modifican con una fucosa unida en α1, 3 acoplada a N-acetil-glucosamina en antenas de tipo lactosamina formando de ese modo estructuras de Lewis x o sialil-Lewis x (figura 5) . Hay dos tipos de estructuras de Lewis x: una con un residuo de galactosa terminal y una con un residuo de N-acetil-galactosamina (GalNac) terminal. Si estos grupos terminales se unen a un ácido siálico, la estructura de Lewis x se denomina estructura de sialil Lewis x. Otra diferencia entre oligosacáridos de tipo sérico y de tipo cerebral es que estos últimos contienen a menudo N-acetil-glucosamina terminal y/o galactosa terminal, y pueden incluir una modificación de N-acetil-galactosamina terminal, mientras que oligosacáridos de tipo sérico contienen habitualmente sólo bajas cantidades de tales estructuras.

45 Los oligosacáridos que se encuentran generalmente en proteínas que circulan en el suero contienen a menudo estructuras fuertemente galactosiladas. Esto significa que una galactosa se une a una N-acetil-glucosamina periférica formando de ese modo una estructura de lactosamina. La glicoproteína está de algún modo protegida de la endocitosis por los receptores de N-acetil-glucosamina (es decir, receptores que reconocen N-acetil-glucosamina terminal) presentes en células reticuloendoteliales hepáticas y macrófagos (Anchord et al. 1978; Stahl et al. 1978) . Los oligosacáridos de tipo sérico también contienen habitualmente ácidos siálicos terminales (también denominado a menudo ácido neuramínico) que protegen a la glicoproteína del aclaramiento a través del receptor de asialoglicoproteína. Estos mecanismos de aclaramiento se aplican específicamente a glicoproteínas que circulan en la sangre y que faltan probablemente en el sistema nervioso central humano (SNC) (Hoffmann et al. 1994) .

55 Están disponibles en la técnica sistemas de expresión recombinantes para la producción de proteínas que comprenden modificaciones de tipo "sérico", tal como se muestra a modo de ejemplo mediante células de ovario de hámster chino (CHO) y células de riñón de cría de hámster (BHK) . Para la producción de proteínas con otras modificaciones, tales como modificaciones de "tipo cerebral", sin embargo, no se han descrito sistemas convenientes de este tipo. Por tanto, hay una necesidad de sistemas de expresión que tengan en cuenta las diferentes modificaciones postraduccionales en proteínas terapéuticas. En particular, existe una necesidad de un sistema de expresión eficaz para proteínas que comprenden modificaciones postraduccionales "de tipo cerebral".

Proteínas que tienen estas necesidades específicas pueden ser beneficiosas en el tratamiento de toda clase de 65 trastornos, entre los que están las enfermedades relacionadas con el SNC, el sistema nervioso periférico y el tejido cardiaco. Los trastornos que afectan al SNC abarcan diferentes tipos de afecciones tales como daño cerebral agudo, enfermedades neurodegenerativas y otras disfunciones tales como epilepsia, esquizofrenia y trastornos del estado de ánimo. Otros trastornos patológicos que podrían aquejar a células y tejidos neurales se deben a lesiones que podrían ser un resultado de hipoxia, trastornos convulsivos, envenenamiento con neurotoxinas, esclerosis múltiple, hipotensión, paro cardiaco, radiación o hipoglucemia. Las lesiones neurales también podrían producirse durante procedimientos quirúrgicos tales como reparación de aneurisma o resección de tumores.

Un ejemplo de una proteína que tiene diferentes papeles que están relacionados al menos en parte con diferencias en modificaciones postraduccionales es una hormona conocida como eritropoyetina (EPO) . La EPO, una proteína famosa por su papel en la diferenciación de células madre hematopoyéticas para dar glóbulos rojos, tiene varias otras funciones, incluyendo funciones en tejidos neurales. Se ha sugerido un papel de la EPO en el desarrollo del SNC (Dame et al. 2001) . También se ha detectado proteína EPO en el líquido cefalorraquídeo (CSF) de recién nacidos y adultos humanos (Juul et al. 1997; Buemi et al. 2000) . La EPO, tal como se presenta en el CSF, parece producirse localmente en el cerebro ya que no cruza la barrera hematoencefálica intacta (Marti et al. 1997; Buemi et al. 2000) . La regulación de la expresión de EPO es específica de tejido, lo que refuerza adicionalmente la hipótesis 15 de que la EPO tiene funciones específicas de tejido que son diferentes en el cerebro y la médula ósea (Masuda et al. 1999; Chikuma et al. 2000; Sasaki et al. 2001) . Se ha postulado por tanto que la EPO, además de su función hematopoyética, puede tener un papel neurotrófico. Los factores neurotróficos se definen como moléculas humorales que actúan sobre neuronas para influir en su desarrollo, diferenciación, mantenimiento y regeneración (Konishi et al. 1993) . Los resultados de varios estudios han demostrado ahora que la EPO puede actuar como un factor neurotrófico (por ejemplo Sadamoto et al. 1998; Brines et al. 2000) . Además de los efectos mencionados de la EPO sobre la eritropoyesis y la neuroprotección, se han descrito otros papeles de la EPO, por ejemplo en células endoteliales y células musculares. Se ha establecido bien en la técnica que el efecto de la EPO (recombinante) depende mucho del patrón de glicosilación de los oligosacáridos presentes en la proteína. Los oligosacáridos Nunidos de la EPO humana son sumamente importantes para su actividad biológica bien conocida: la estimulación de la eritropoyesis (Takeuchi y Kobata 1991; Wasley et al. 1991; Tsuda et al. 1990; Morimoto et al. 1996; Takeuchi et al. 1989; Misaizu et al. 1995) .

En el caso de la EPO, también puede hacerse referencia a EPO de tipo sérico (una EPO "de tipo renal", o "de... [Seguir leyendo]

1. Composición que comprende moléculas de eritropoyetina recombinantes que comprenden glicanos N-unidos, caracterizada porque el número promedio de estructuras de lewis-X en glicanos N-unidos por molécula de 5 eritropoyetina es al menos de 2, 7.

2. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque el número promedio de estructuras de lewis-X en glicano N-unido por molécula de eritropoyetina es al menos de aproximadamente 3, 6.

3. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque el número promedio de estructuras de lewis-X en glicanos N-unidos por molécula de eritropoyetina es al menos de aproximadamente 4, 1.

4. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque el número promedio de estructuras de lewis-X en glicanos N-unidos por molécula de eritropoyetina es al menos de aproximadamente 5, 7. 15

5. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que los glicanos N-unidos en dichas moléculas de eritropoyetina son principalmente estructuras biantenarias.

6. Preparación farmacéutica que comprende una composición de moléculas de eritropoyetina recombinantes según 20 cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para su uso como medicamento.

8. Uso de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para la preparación de un

medicamento para el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en isquemia, una lesión por reperfusión, un trastorno inducido por hipoxia, una enfermedad inflamatoria, un trastorno neurodegenerativo y daño agudo al sistema nervioso central o periférico.