Un método para identificar un agente que inhibe el crecimiento tumoral,

que comprende

a) poner en contacto un tumor de un sujeto no humano o un animal hospedador no humano con un agentecandidato, en el que el tumor comprende células madre tumorales que comprenden núcleos en forma decampana, y en el que algunos o todos los núcleos en forma de campana están en una configuración intermediareplicativa asociada con ADNmc;

b) mantener el tumor en contacto con el agente candidato en condiciones adecuadas para que el agenteinteraccione con el tumor;

c) escindir una muestra del tumor y determinar la presencia de, ausencia de, o cantidad de ADNmc en unaconfiguración intermedia replicativa en núcleos en forma de campana, en la muestra tumoral después delcontacto en la etapa b); y

d) comparar la presencia de, ausencia de, o cantidad de ADNmc en una configuración intermedia replicativa ennúcleos en forma de campana, en la muestra tumoral después del contacto con el agente candidato con lapresencia de, ausencia de, o cantidad de ADNmc en una configuración intermedia replicativa en núcleos enforma de campana en una muestra de control,

mediante el cual una reducción en la cantidad de, o ausencia de ADNmc en una configuración intermedia replicativaen núcleos en forma de campana, en la muestra después del contacto con el agente candidato indica que el agenteinhibe el crecimiento tumoral.

Métodos para inhibir el crecimiento tumoral marcando como diana el intermedio de replicación de ADNmc de células madre tumorales 5

Antecedentes de la invención

Los científicos han reconocido el parecido de las células tumorales y las construcciones tisulares patológicas (tales como teratocarcinomas) con las células y tejidos de embriones tempranos. Las células madre embrionarias normales pero no diferenciadas son capaces de dar lugar a órganos por procesos no definidos que lógicamente tienen que incluir el rápido aumento en el número de células y la diferenciación en un blastema de órgano y posterior organogénesis. Los tumores malignos crecen a tasas similares a los fetos tempranos y contienen nichos que están histológicamente no diferenciados u organizados con un aspecto histológico de tejido normal.

Los tumores y los tejidos fetales parecen compartir muchas moléculas y procesos en común. Por ejemplo, los glucosaminoglucanos antigénicos complejos en la superficie celular, los "antígenos carcinoembrionarios", se expresan tanto en tejidos fetales como en tumores, como las moléculas de adhesión celular. La oncogénesis como la ontogénesis parece proceder por un descenso lineal a través de una serie en expansión de células madre. Solamente una pequeña fracción de células de un tumor humano tiene la capacidad, solas o en concierto con otras células, de formar nuevos tumores como xenoinjertos en roedores inmuno-suprimidos. Experimentos de xenoinjerto por dilución limitante han demostrado que una o más células entre las células tumorigénicas putativa presentan propiedades tipo célula madre ya que son capaces de generar nuevos tumores que contienen células madre adicionales así como de regenerar las poblaciones fenotípicamente mixtas de células presentes en el tumor original.

El concepto de monoclonalidad de tumores se estableció en los primeros años de 1900. Más recientemente, se determinó que casi todas las formas de cáncer de aparición tardía pasan a través de un periodo prolongado de preneoplasia y que estas colonias preneoplásicas eran en sí mismas monoclonales y resultantes de más de una mutación citogenética rara del ADN germinal. A principios del siglo 21, intentos directos por enriquecer poblaciones de células tumorales con células "madre" para experimentos de transplante/dilución habían demostrado que no solamente eran células madre tisulares el origen probable de preneoplasia, sino que los propios tumores contenían células "madre". La moderna actualización de la hipótesis ha sugerido que los tumores son de hecho estructuras fetales heterogéneas razonablemente bien organizadas. Se esperaría que las células madre 'carcinoembrionarias' aumentaran en número y dieran lugar a tipos celulares diferenciados que poblarían las nichos altamente heterogéneos dentro de la masa tumoral.

Se han usado diversos marcadores antigénicos empleados en el campo de las células madre para enriquecer de células capaces de regenerar tejidos o tumores de forma ostensible a un elevado grado. Ninguna célula dentro de estas poblaciones enriquecidas, sin embargo, ha mostrado ninguna propiedad celular morfológica microscópica que las marque como células madre. Si es cierto que los tumores surgen de una única célula madre, se requiere un medio para identificarlas y recogerlas como población homogénea de células madre suficiente para el análisis de analitos moleculares y bioquímicos. Es de principal importancia la identificación de dianas celulares tumorales para el desarrollo de nuevas terapias dirigidas a inhibir selectivamente el crecimiento, o eliminación, de las células madre de neoplasias y preneoplasias.

45 GOSTJEVA ET AL describe "Bell-shaped nuclei dividing by symmetrical and asymmetrical nuclear fission have qualities of stem cells in human colonic embr y ogenesis and carcinogenesis" en: CANCER GENETICS AND CYTOGENETICS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHING, NUEVA YORK, NY, EEUU vol. 164, nº 1, 1 de enero de 2006 páginas 16-24.

WADKINS R. M. ET AL describe "Actinomycin D binds to metastable hairpins in single-stranded DNA" en: BIOCHEMISTRY 25 AUGUST 1998, vol. 37, nº 34, 25 de agosto 1998 páginas 11915-11923.

WHITE R.J. ET AL describió "Development of mitoxantrone" en: INVESTIGATIONAL NEW DRUGS 1985, vol. 3, nº 2, 1985 páginas 85-93.

55 Sumario de la invención

Son necesarias mutaciones dentro de las poblaciones de células madre para generar células madre cancerosas. La moderna hipótesis de la "célula madre tumoral" derivada de las observaciones patológicas del siglo 19 postula que los tumores contienen subconjuntos únicos de células que tienen propiedades similares tanto a células madre normales como a tejidos fetales. Estas células proliferan extensivamente a través de rondas asimétricas y no mitóticas de divisiones celulares. Esta población de células probablemente es auto-renovante y es responsable del crecimiento y mantenimiento de la mayoría de los tumores. Por tanto, se cree ampliamente que la inhibición de la división de las células madre tumorales representa una nueva intervención terapéutica que promete eficacia

65 mejorada sobre los enfoques actuales.

La presente invención se basa en observaciones que indican que el periodo de crecimiento fetal/juvenil humano está asociado con una elevada tasa de mutación en el linaje de células madre y que este linaje emplea un modo previamente no detectado de segregación y replicación del ADN. Previamente descritas en la solicitud de patente de Estados Unidos número 2006/0063144 (patente de Estados Unidos 7.427.502) y el documento PCT/US06/047136 5 (patente internacional, publicación nº WO 2007/067795) , las células madre tumorales y fetales se caracterizan por un morfotipo nuclear único mencionado como núcleos en forma de campana. (Los núcleos en forma de campana también se encuentran en sincitios y se entiende que los métodos de la presente invención descritos en este documento también abarcan núcleos en forma de campana presentes en sincitios así como en células) . Las células madre tumorales y fetales que contienen núcleos en forma de campana se mencionan en este documento como metacariotas. La presente invención se basa en la observación de importancia primordial, descrita en este documento, de que los núcleos en forma de campana de células madre tumorales y fetales experimentan una forma única de replicación. Esta forma única de replicación genómica implica un intermedio de replicación con una configuración estructural nuclear en la que los núcleos en forma de campana se separan (como en una separación "copa-a-copa") , y que durante la separación una gran parte del genoma primero se segrega en ADN monocatenario

(ADNmc) antes de la replicación genómica. Esta observación está en contraste con las previas observaciones de división de células humanas donde la síntesis del ADN procede por copia iterativa de cortos tramos de ADN seguida de condensación y separación de la cromátida en la mitosis en forma de ADN bicatenario (ADNbc) .

Además, de igual importancia, es la observación de que durante esta forma única de replicación genómica, puede observarse una cantidad sustancial del ADNmc aparte del ADNmc contenido dentro de los núcleos en forma de campana, además este ADNmc está asociado con y es indicativo de la configuración del intermedio replicativo único para la replicación de células madre tumorales. De forma importante, estas observaciones clave, que durante la división nuclear en forma de campana, las células madre tumorales y fetales y sincitios están en una configuración intermedia donde el genoma es, durante un periodo de tiempo significativo y explotable, ADN sustancialmente

monocatenario (ADNmc) , dentro o fuera de los núcleos en forma de campana, pueden formar la base para métodos de ensayo de la eficacia de agentes y terapias anti-cáncer mediante de la detección de núcleos en forma de campana que contienen ADNmc en la configuración intermedia replicativa o mediante la detección de ADNmc solo. Además, este modelo animal (o vegetal) de replicación genómica única para células madre tumorales y fetales y sincitios puede formar la base del diseño inteligente de nuevas terapias contra el cáncer abordando la inhibición o alteración de esta configuración intermedia replicativa de las células madre.

Por ejemplo, en esta configuración intermedia replicativa única de las células madre tumorales hay presente una gran cantidad de ADNmc dentro de los núcleos en forma de... [Seguir leyendo]

1. Un método para identificar un agente que inhibe el crecimiento tumoral, que comprende

a) poner en contacto un tumor de un sujeto no humano o un animal hospedador no humano con un agente candidato, en el que el tumor comprende células madre tumorales que comprenden núcleos en forma de campana, y en el que algunos o todos los núcleos en forma de campana están en una configuración intermedia replicativa asociada con ADNmc; b) mantener el tumor en contacto con el agente candidato en condiciones adecuadas para que el agente

interaccione con el tumor; c) escindir una muestra del tumor y determinar la presencia de, ausencia de, o cantidad de ADNmc en una configuración intermedia replicativa en núcleos en forma de campana, en la muestra tumoral después del contacto en la etapa b) ; y d) comparar la presencia de, ausencia de, o cantidad de ADNmc en una configuración intermedia replicativa en

núcleos en forma de campana, en la muestra tumoral después del contacto con el agente candidato con la presencia de, ausencia de, o cantidad de ADNmc en una configuración intermedia replicativa en núcleos en forma de campana en una muestra de control,

mediante el cual una reducción en la cantidad de, o ausencia de ADNmc en una configuración intermedia replicativa 20 en núcleos en forma de campana, en la muestra después del contacto con el agente candidato indica que el agente inhibe el crecimiento tumoral.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra tumoral se obtiene de un tumor sólido resultante de un

xenoinjerto en un organismo hospedador. 25

3. El método de la reivindicación 1, en el que ADNmc se detecta tiñendo la muestra con naranja de acridina y visualizando el ADNmc.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el agente candidato

a) aborda ADN monocatenario, preferiblemente en el que el agente candidato b) altera la hibridación del ADN, degrada ADN monocatenario, o altera la replicación del ADN a partir de un molde de ADN monocatenario.

5. El método de la reivindicación 1 en el que, en la etapa c) , antes de la tinción, la muestra se expone a RNasa a una concentración de 2 mg/ml durante 2 horas a 37ºC en un baño de agua, se lava en EDTA durante 1 minuto, se aclara en agua de calidad molecular y se tiñe inmediatamente en solución de naranja de acridina: 0, 05 g de naranja de acridina diluidos en 500, 0 ml de agua destilada y 5, 0 ml de ácido acético, estando el pH a temperatura ambiente en un intervalo de 3, 1-3, 4, las muestras se colocan en un tarro de Coplin en la oscuridad a temperatura ambiente, se

tiñen durante 30 minutos, se aclaran en ácido acético al 0, 5% en alcohol al 100%, en alcohol al 100%, en PBS antes de la visualización en un microscopio de fluorescencia mientras aún están húmedas con el cubreobjetos sobre ellas

Figura 20. Comparación paralela del patrón de intermedios de ADNmc en núcleos en forma de campana teñidos por naranja de acridina (ADNbc verde, ADNmc rojo) y anticuerpos contra ADNmc (núcleo en azul por DAPI, ADNmc en verde por FITC) : a y c, el naranja de acridina revela 'anillos rojos' (cabezas de flecha) de ADNmc similar (cabezas de flecha) al que se observa en núcleos teñidos con anticuerpos contra ADNmc (b) ; e, f señal roja en tinción con naranja de acridina y señal verde en tinción con anticuerpos contra ADNmc (marcados con flecha) que muestran similitud en la distribución del ADNmc sobre el área completa del núcleo en forma de campana