Método y sistema de retro-iluminación y análisis digital de imagen para la valoración de placas de ensayo colorimétrico.

Método de valoración de pruebas diagnósticas colorimétricas consistente en tomar una fotografía digital de una placa y aplicar al fichero obtenido un programa informático que analiza y cuantifica las componentes de color de los píxeles correspondiente a cada uno de los pozuelos de la placa. El·tipo de tinte determina las componentes de color adecuadas para cada caso. El programa requiere del usuario la ubicación de las referencias positivas y negativas, calcula la localización de los pozuelos con o sin intervención del usuario, y determina los parámetros de análisis colorimétrico en función del tipo de tinte con o sin intervención del·usuario.

Sistema de iluminación para tornar la fotografía digital por retro-iluminación con una lámina electroluminiscente.

Método y sistema de retro-iluminación y análisis digital de imagen para la valoración de placas de ensayo colorimétrico.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método y a un sistema para la valoración de placas de ensayo colorimétrico mediante técnicas de análisis digital de imágenes. La invención se encuadra dentro de los métodos y sistemas de análisis de imagen digital para la realización de diagnósticos clínicos.

Estado de la técnica

Los tests colorimétricos permiten determinar la concentración de una solución de cierta sustancia a partir de la intensidad del color resultante de una reacción. Este principio se emplea en diagnóstico inmunológico, genético, pruebas de paternidad, medicina forense, detección de alergenos alimentarios, y en supervisión del medio ambiente. La herramienta de diagnóstico inmunológico denominada "ensayo enzimático inmunoespecífico" (ELISA) es probablemente el test colorimétrico más usado. Es específica para la detección de sustancias de naturaleza proteica, y evalúa la compatibilidad antígeno-anticuerpo en la que uno de los reaccionantes está ligado a una enzima (peroxidasa de rábano picante ó HRP) capaz de modificar el color de un tinte. Este tipo de pruebas constituyen desde su introducción en 1987 una herramienta fundamental en inmunología clínica para la detección de microorganismos o de anticuerpos en fluidos corporales y se emplean en las campañas de erradicación de enfermedades. Se fundamentan en la elevada especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo, y no precisan sustancias tóxicas ni radioactivas, siendo el resultado un cambio de color en los reactivos. La posibilidad de conocer de forma casi inmediata el resultado de un ensayo colorimétrico permite al clínico determinar el grado de exposición al agente patógeno y así poder tomar decisiones sobre tratamientos o medidas de policía sanitaria, sin exponer a otros sujetos susceptibles.

La reacción, y por tanto la intensidad del color resultante, son proporcionales a la concentración del producto a detectar en la muestra. Se determina por fotometría, midiendo la absorbancia a una longitud de onda específica para el tinte empleado, que suele ser 450 nm por tratarse de tetrametil benzidina (TMB) en medio ácido, ó 650 nm en medio alcalino. Se emplea también sulfonato de azino bietil benzotiazolina (ABTS), con absorbancia máxima a 405 nm, que corresponde al color verde. En el pasado se ha usado diaminobenzeno (OPD), con un pico de absorción a 490 nm, pero se ha abandonado su uso por ser cancerígeno.

Las pruebas de ensayo colorimétrico se realizan habitualmente en placas de 8 cm x 12 cm de poliestireno con una matriz de 8 x 12 pozuelos de 1 cm de profundidad y 0.7 cm de diámetro, aunque también existen en el mercado placas con pozuelos de menor tamaño dispuestos en una matriz de 384 (16 x 24) ó de 1536 (32 x 48). En el caso de las pruebas ELISA, los pozuelos están recubiertos interiormente con sustancias inmunológicamente activas y se llenan con una muestra fluida de analito, se aclaran y se vuelven a rellenar con un reactivo antes de leer el resultado del test. Existen varios tipos de prueba ELISA, en función del tipo de recubrimiento del pozuelo y del reactivo empleado:

- ELISA indirecto, para determinar concentraciones de anticuerpos, pozuelos recubiertos con antígeno, y reactivo con anticuerpo conjugado a enzima y específicamente afín para el anticuerpo sérico a detectar.

- ELISA sándwich, para detectar proteínas, pozuelos recubiertos con un anticuerpo específico para la proteína, y reactivo con anticuerpos conjugados a enzima específicos para el antígeno.

- ELISA competitivo, para determinar concentraciones de anticuerpos, se recubre el pozuelo con antígeno, el analito se incuba con antígeno, el reactivo contiene un anticuerpo específico para el anticuerpo sérico y está conjugado a la enzima.

Se incluyen en cada placa pozuelos con muestras positivas y negativas de control como referencia. Estas pruebas se desarrollaron originalmente con el objetivo de ser evaluados de forma subjetiva por el operario, pero tal práctica se ha abandonado por presentar una elevada dependencia ambiental (del grado de entrenamiento y de la iluminación) así como muy baja precisión y falta de repetibilidad. Actualmente se emplean espectrofotómetros para medir la intensidad de la luz a una determinada longitud de onda. Pese a que las pruebas colorimétricas están basadas en elementos (reactivos y placas) de bajo coste, los espectrofotómetros que se emplean para determinar la absorbancia suelen estar entre los equipos más costosos del laboratorio de análisis. Son demasiado voluminosos para ser transportados con facilidad, y no suelen ofrecer la posibilidad de documentar las lecturas realizadas.

El dispositivo "micro ELISA reader", recogido en la patente US2004087010, aborda alguna de las limitaciones citadas para el sistema clásico de lectura de placas ELISA y puede mejorar la productividad del método, pero presenta notables inconvenientes. Al estar basado en la exploración secuencial de los pozuelos, dicho dispositivo solo acepta un determinado tipo de placas. Por el contrario, la presente propuesta realiza una lectura simultánea de todos lo pozuelos, para cualquier número de pozuelos, lo que evita interferencias temporales y explota adecuadamente la resolución gráfica alcanzable con cámaras de imagen digital muy ubicuas y asequibles, en un dispositivo sencillo, libre de mecanismos y de transporte sencillo. El "micro ELISA reader" recurre a dispositivos mecánicos que requieren protección contra la entrada de partículas, siendo susceptible de sufrir los problemas asociados a la presencia de partes móviles así como un deterioro progresivo. Se trata de un dispositivo empotrado en un ordenador personal por lo que no se presta al uso en condiciones de campo, sin facilitar especialmente la transmisión de datos dada la gran variedad de medios -incluidos los inalámbricos- de que se dispone actualmente para ello. Por último, la presencia de reactivos líquidos que pueden verterse con facilidad impide su empleo en condiciones de baja estabilidad, con el operador de pie ó a bordo de un vehículo.

Bibliografía

David S. Hage, "Immunoassays", Anal. Chem., 71 (1999) 294R-304R.

Tsai Chung-Hua, "Micro ELISA reader", patente: US2004087010 publicada el 2004-05-06.

Descripción de la invención

La presente invención tiene como objeto evaluar placas de ensayo colorimétrico mediante un sistema de retro-iluminación y análisis digital de imagen.

Descripción de las figuras

A continuación se describirán ejemplos del método y sistema, y el aspecto del aparato inventado, con referencias a las siguientes figuras:

Figura 1: Muestra la planta del sistema con cortes sucesivos. 1- Dispositivo emisor de luz. 2- Placa. 3- Elemento difusor. 4- Guía del borde da la placa. 5- Pozuelos. 6- Soporte.

Figura 2: Muestra un corte transversal del iluminador con un filtro difusor opcional. 1- Dispositivo emisor de luz. 3- Elemento difusor. 5- Pozuelos. 7- Sustancia coloreada.

Figura 3: Muestra la configuración espacial de los elementos iluminadores y las dimensiones globales. Dimensiones en mm. (1) Iluminadores. (2) Soporte.

Figura 4: Indica el esquema eléctrico del sistema de retro-iluminación basado en lámina EL con inversor y elemento de control. 1- Dispositivo emisor de luz. 7- Inversor. 8- Control del inversor.

Descripción detallada de la invención

El método de valoración de las pruebas diagnósticas colorimétricas consiste en tomar una fotografía digital de una placa y aplicar al fichero obtenido un programa informático que analiza y cuantifica las componentes de color de los pixeles correspondiente a cada uno de los pozuelos de la placa. El programa requiere del usuario la ubicación de las referencias positivas y negativas, calcula la localización de los pozuelos con o sin intervención del usuario, y determina los parámetros de análisis colorimétrico en función del tipo de tinte con o sin intervención del usuario. El tipo de tinte determina la componente de color adecuada para cada caso, que corresponde a la componente azul del formato de pixel RGB en el caso de tintes con absorbancia máxima a 450 nm, y a la componente roja en el caso de tintes...

1. Sistema de retro-iluminación para fotografiar placas de ensayo colorimétrico constituido por una lámina electroluminiscente de tamaño suficiente como para cubrir toda la extensión de los pozuelos, y caracterizado por situar la placa de ensayo colorimétrico sobre la lámina electroluminiscente.

2. Sistema de retro-iluminación para fotografiar placas de ensayo colorimétrico, según la reivindicación 1, caracterizado por disponer en el difusor de unas marcas guía para el borde de la placa de ensayo colorimétrico.

3. Sistema de retro-iluminación para fotografiar placas de ensayo colorimétrico, según la reivindicación 1 y 2, caracterizado por situar un elemento difusor de luz inmediatamente encima de la placa de ensayo colorimétrico.

4. Método para la valoración de placas de ensayo colorimétrico que, utilizando el sistema de retroiluminación descrito en las reivindicaciones 1, 2 y 3, comprende las siguientes etapas: