Método para la determinación de la actividad funcional de la ruta de evacuación de MRP2 y/o MRP3 de un humano o un animal,

cuyo método comprende:

(i) determinación del nivel del derivado del ácido bílico en la sangre de dicho humano o animal en un intervalo de tiempo predeterminado después de una introducción de una cierta cantidad de un derivado de ácido bílico en dicho sujeto, y

(ii) utilizar la determinación obtenida en la etapa (i) para indicar la actividad funcional de la ruta de evacuación de MRP2 y/o MRP3 de dicho sujeto.

Método prognóstico.

Objeto de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo método para la determinación de la actividad funcional de la ruta de evacuación MRP2 y/o MRP3 de un humano o un animal y a la utilización de un derivado de ácido bílico en dicho método.

Antecedentes de la invención

La MRP2/Mrp2 (ABCC2/Abcc2), conocida también como proteína 2 de resistencia a fármacos múltiples, es un miembro de la subfamilia ABCC de la superfamilia del transportador de casete de unión a ATP. Se facilita un resumen de la familia del transportador de casete de unión a ATP en "Superfamilia del trasportador (ABC) de casete de unión a ATP humana" por Michael Dean del National Cáncer Institute de Frederick, Maryland, publicado por el US National Center for Biotechnology Information. La MRP2 se expresa en el dominio apical de hepatocitos, enterocitos del intestino delgado próximo y de las células tubulares renales próximas, así como en el cerebro y en la placenta.

La MRP2 es importante clínicamente dado que modula la farmacocinética de muchos fármacos y su expresión y actividad son también alterados por una serie de fármacos y de enfermedades. Por ejemplo, la expresión de MRP2 es alterada en pacientes con enfermedades de hígado tales como cirrosis biliar primaria, colestasis (por ejemplo, colestasis inducida por fármacos), enfermedades del hígado por grasas, enfermedades del hígado de tipo alcohólico, colangitis esclerosante primaria o hepatitis vírica. En el riñón, la MRP2 funciona en la eliminación renal de sustratos de la sangre hacia la orina. En el hígado, la MRP2 es la exportadora principal de aniones orgánicos desde el hígado a la bilis. La MRP2 puede transportar sales bílicas sulfatadas y glucoronidadas, así como otros aniones orgánicos y/o sus conjugados con glucuronato, glutatión y sulfato [Gerk y otros J pharmacol Exp Ther 2002 Aug; 302 (2): 407-415]. Además del transporte de conjugados la MRP2 transporta una serie de moléculas incluyendo quimioterapéuticos del cáncer, uricosúricos, antibióticos, leucotrienos, glutatión, toxinas y metales pesados. La MRP2 juega también un importante papel en la eliminación de glucuronósidos de bilirrubina de hepatocitos hacia la bilis. El gen de la MRP2 es mutado en pacientes con el síndrome de Dubin-Johnson, una enfermedad humana del transporte de iones orgánicos. La ausencia de MRP2 funcional de la membrana canalicular provoca hiperbilirrubinemia conjugada, observado por la enfermedad hereditaria del síndrome de Dubin-Johnson.

La pérdida de función del MRP2 es frecuentemente bien tolerada y compensada por la sobrerregulación de otros transportadores de membrana, particularmente la proteína 3 de resistencia a fármacos múltiples (MRP3, conocida también como ABCC3) en el miembro basolateral de hepatocitos [Nies y otros Pflugers Arch (2007) 453:643-659], Lo mismo que la MRP2, MRP3 es un miembro de la subfamilia ABCC de la superfamilia de transportador de casete de unión a ATP. La MRP3 se encuentra presente en el intestino, riñón y en el hígado.

El conocimiento del estado de la actividad de MRP2/3 de un sujeto podría ser utilizado por lo tanto para indicar una amplia gama de estados posibles.

Descripción de la invención

Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención dar a conocer un método para la determinación de la actividad funcional de la ruta de eliminación de MRP2 y/o MRP3 de un humano o un animal.

Los inventores han descubierto de manera inesperada que la MRP2 es el transportador más destacado responsable de la secreción biliar de colil lisil fluoresceína (CLF), conocida también como fluoresceína lisicol, y que la MRP3 es responsable de la excreción basolateral de CLF. De acuerdo con ello, la CLF y otros ácidos bílicos que tienen una ruta similar de eliminación/metabólica pueden ser utilizados en la determinación de la actividad funcional de la ruta de evacuación MRP2/3.

La presente invención es particularmente sorprendente teniendo en cuenta la materia dada a conocer por Mills y otros en Biochim Biophys Acta 1991 Dec 6; 1115(2): 151-156. Dichos investigadores mostraron que en ratas la proporción de excreción biliar de CLF después de inyección en la vena yugular tiene una cinética similar a la del glicocolato, cuyo transporte es conocido que es mediado por ABCB11. El ABCB11 es un miembro de la subfamilia ABCB de la superfamilia de transportador (ABC) de casete de unión a ATP.

Otras pruebas que condujeron a la creencia de que el CLF es transportado con intermedio de ABCB11 fueron proporcionadas por Baxter y otros [Biochim Biophys Acta 1995 Jun 6; 1256 (3) : 374-380]. Baxter y otros administraron glicocolato y CLF a hígados de ratas perfundidos y aislados en condiciones de reciclado y observaron que el CLF era capaz de incrementar la producción de fosfolípidos y colesterol de manera similar a la que se había encontrado para el glicocolato. Se mostró en el mismo estudio que el hígado de rata tiene una capacidad mucho mayor de transferencia de glicocolato (GC) desde el perfundido a la bilis que el CLF y de forma concomitante que el incremento en la producción de fosfolípidos y colesterol era menor con CLF en comparación con GC.

En un estudio posterior [Mills y otros en J Hepatol 1999 Oct; 31(4): 678-684], Mills y otros investigaron ABCC2/ Abcc2 como transportador posible para CLF. Sin embargo, llegaron a una conclusión de un estudio con ratas Wistar normales y TR (con deficiencia de Abcc2) que Abcc2 no estaba involucrada en la excreción biliar de CLF, basándose en la observación de excreción biliar similar en ambas cepas.

Como resumen, antes de las presentes investigaciones, la totalidad de la técnica anterior sobre este tema llegaba unánimemente a la conclusión de que la CLF era transportada desde el hígado a la bilis por la ruta ABCB11/Abcb11, en vez de la ruta ABCC2/Abcc2, y por lo tanto no se habría considerado como agente para su utilización en un método para la determinación de la actividad de MRP2/3.

De acuerdo con la presente invención se da a conocer un método para la determinación de la actividad funcional de la ruta de eliminación de MRP2 y/o MRP3 de un humano o un animal, cuyo método comprende:

(i) determinación del nivel del derivado del ácido bílico en la sangre de dicho humano o animal en un intervalo de tiempo predeterminado después de una introducción de una cierta cantidad de un derivado de ácido bílico en dicho sujeto, y

(ii) utilizar la determinación obtenida en la etapa (i) para indicar la actividad funcional de la ruta de evacuación de MRP2 y/o MRP3 de dicho sujeto.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se da a conocer un método para llevar a cabo la prognosis o diagnosis en un humano o animal, cuyo método comprende:

determinación del nivel de un derivado de ácido bílico en la sangre de dicho humano o animal en un intervalo de tiempo predeterminado después de la introducción de una cantidad del derivado de ácido bílico en dicho sujeto.

Caracterizado porque la determinación obtenida es utilizada para indicar la actividad funcional de la ruta de evacuación de MRP2 y/o MRP3 del sujeto.

El término "determinación" tiene en este contexto un significado amplio. Comprende tanto el análisis cuantitativo para cuantificar el nivel o cantidad de derivado de ácido bílico en la muestra como análisis cualitativo para detectar si el ácido bílico se encuentra presente o no, y en caso apropiado el grado al cual se encuentra presente. Por lo tanto, no es esencial para este método la obtención de un valor numérico para el nivel del derivado de ácido bílico en la sangre. Por ejemplo, la determinación de que el nivel del derivado de ácido bílico en la sangre se encuentra dentro de un cierto intervalo puede ser utilizado para evaluar la actividad funcional de la ruta de MRP2 y/o MRP3. Por analogía, las palabras "determinar" y "determinación" reciben un significado similar.

La determinación del nivel de ácido bílico puede ser llevada a cabo tal como se describe en la descripción de la patente europea EP 1 003 458 (la totalidad de su texto es aportada como referencia y está destinado a formar parte integral de la materia que se da a conocer). Dicha descripción da a conocer la utilización de derivados de ácido bílico dotados de color o fluorescentes en sujetos humanos para determinar la función del hígado del sujeto. Un ejemplo de este derivado del ácido bílico indicado en EP 1 003... [Seguir leyendo]

1. Método "in vitro" para determinar la actividad funcional de la ruta de evacuación de MRP2 y/o MRP3 a partir de muestras de sangre recogidas de un sujeto humano o animal después de la introducción de una cierta cantidad de un derivado de ácido bílico en dicho sujeto, caracterizado porque comprende las siguientes etapas llevadas a cabo en muestras de sangre del sujeto:

(i) determinación del nivel del derivado del ácido bílico en muestras de sangre de dicho humano o animal en un intervalo de tiempo predeterminado, y

(ii) utilizar la determinación obtenida en la etapa (i) para indicar la actividad funcional de la ruta de evacuación de MRP2 y/o MRP3 de dicho sujeto.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que el método comprende una etapa adicional de utilización de la determinación obtenida para conseguir un valor numérico, en el que el valor numérico indica la actividad funcional de la ruta de evacuación de MRP2 y/o MRP3 del sujeto.

3. Método, según la reivindicación 1 o 2, en el que la determinación obtenida es comparada, como mínimo, con un estándar para indicar la actividad funcional de la ruta de evacuación de MRP2 y/o MRP3 del sujeto.

4. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el nivel del derivado de ácido bílico en la sangre de dicho humano o animal se determina en dos o más intervalos de tiempo predeterminados después de la introducción de una cantidad de dicho derivado de ácido bílico en el sujeto.

5. Método, según la reivindicación 4, en el que el método comprende además la etapa de determinar la pendiente de un gráfico logarítmico-lineal de las determinaciones obtenidas con respecto al tiempo.

6. Método, según la reivindicación 4, en el que el método comprende además la etapa de determinar un área por debajo de la curva de eliminación de plasma derivada de las determinaciones obtenidas.

7. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el derivado de ácido bílico comprende un marcador tal como un colorante o una fluorescencia.

8. Método "in vitro", según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, cuyo método comprende además la etapa de proporcionar, como mínimo, una muestra de sangre que ha pasado por el hígado del sujeto y cuya muestra ha sido recogida en un intervalo de tiempo predeterminado, de manera que la muestra o muestras de sangre son procesadas para obtener plasma de la sangre o suero de la sangre.

9. Método, según la reivindicación 8, en el que la muestra o muestras de la sangre son procesadas por centrifugación.

10. Método, según la reivindicación 8 ó 9, en el que las proteínas de la sangre son separadas del plasma/suero de la sangre.

11. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el derivado de ácido bílico comprende (a) una fracción esteroide que tiene (i), como mínimo, un sustituyente seleccionado entre el grupo que consiste en el sustituyente de 3-hidroxilo, un sustituyente de 7-hidroxilo y un sustituyente de 12-hidroxilo, y (ii) un grupo carboxilo fijado por medio de un enlace de amida a la cadena lateral de la fracción esteroide; y (b) una fracción activa que se tiene que direccionar al hígado, cuya fracción activa está fijada a un átomo de carbono α con respecto al grupo carboxilo.

12. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el derivado de ácido bílico tiene una fórmula general (I):

en la que A es seleccionada entre el grupo que consiste en α-OH y β-OH; B es seleccionada entre el grupo que consiste en α-H y β-H; C es seleccionada entre el grupo que consiste en -H, α-OH y β-OH; o B y C conjuntamente forman un doble enlace; D es seleccionada del grupo que consiste en -H, α-OH y β-OH; E es seleccionada del grupo que consiste en -H, α-OH y β-OH; L es una fracción de enlace; J es una fracción de color o fluorescencia; y n es 0 ó 1.

13. Método, según la reivindicación 12, en el que J es o incluye una fracción de fluoresceína, rodamina u otra fracción fluorescente.

14. Método, según la reivindicación 12 ó 13, en el que la fracción de enlace tiene terminación N en su extremo fijado a la fracción activa J, y L es seleccionado del grupo que consiste en: -(CH₂)_nNH, en el que n es 3 ó 4, -(CH₂)₄ NH-(CH₂)₃NHC(=NH)NH-, y -(CH₂)₂-CH(OH)CH₂NH-.

15. Método, según la reivindicación 12 ó 13, en el que la fracción -NH-CH(COOH)-L- de la fórmula general (I) se deriva de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en S-adenosilhomocisteína, S-adenosilmetiodina, S-aminoimadazol-4-carboxamida, asparagina, cadaverina, cistamina, citrullina, ácido diaminopimélico, ácido 2,4-diaminobutírico, cisteamina, glutamina, 3-hidroxiquinurenina, quinurenina, putrescina y negamicin.

16. Método, según la reivindicación 11, en el que la fracción esteroide del derivado de ácido bílico se basa en un ácido seleccionado del grupo que consiste en ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido hiodesoxicólico, ácido hiocólico, ácido α-, β- u ω-muricólico, ácidos no bílicos, ácido litocólico, ácido 3 β-hidroxicolenoico, ácido ursodesoxicólico y ácido alocólico (ácido 5α-colan-24-oico).

17. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 a 10, en el que el derivado de ácido bílico es colil-lisil-fluoresceína (CLF) que tiene la fórmula:

18. Método, según la reivindicación 17, en el que el derivado de ácido bílico es una sal de colil-lisil-fluoresceína.

19. Utilización de un derivado de ácido bílico para determinar la actividad funcional de la ruta de evacuación de MRP2 y/o MRP3 de un humano o un animal.

20. Utilización de la determinación de la actividad funcional de MRP2 y/o MRP3 obtenida mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para determinar la función hepática de un humano o un animal.

21. Método para la determinación de la actividad funcional de la ruta de evacuación de MRP2 y/o MRP3 de un humano o animal sustancialmente tal como se ha descrito.

22. Utilización de un derivado de ácido bílico para determinar la actividad funcional de la ruta de MRP2 y/o MRP3 de un humano o animal sustancialmente tal y como se ha descrito.

23. Método "in vitro" para determinar la actividad funcional de la ruta de absorción de OATP1B3 de un sujeto humano o animal, dicho método comprende: