Método para valorar la capacidad antioxidante en muestras biológicas.

La presente invención se refiere a un método para valorar la concentración y la capacidad antioxidante del ácido úrico en muestras ya sean biológicas, en muestras procedentes de la industria alimentaria, en cosméticos ... Además mediante la presente invención se permite determinar la capacidad antioxidante sin la contribución del ácido úrico y la capacidad antioxidante total de una muestra.

Método para valorar la concentración y la capacidad antioxidante del ácido úrico.

La presente invención se refiere a un método para valorar la concentración y la capacidad antioxidante del ácido úrico en muestras ya sean biológicas, en muestras procedentes de la industria alimentaria, en cosméticos... Además mediante la presente invención se permite determinar la capacidad antioxidante sin la contribución del ácido úrico y la capacidad antioxidante total de una muestra.

Estado de la técnica anterior

El conocimiento de los efectos nocivos de los radicales libres y especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) ha propiciado un interés creciente en la valoración del estatus antioxidante de los individuos en estudios experimentales, epidemiológicos y clínicos así como de la capacidad antioxidante de determinadas sustancias, bebidas y alimentos. Por ello, se han desarrollado multitud de metodologías para la determinación de la capacidad antioxidante total (TAC), tales como el FRAP (Capacidad del Plasma de Reducir el ión Férrico), el TEAC (Capacidad Antioxidante Equivalente de Trolox), el ensayo de quimioluminiscencia o el CUPRAC (Ensayo de Reducción del Cobre(II) ó Capacidad Antioxidante de Reducción del ión Cúprico) entre otros [Karadag A, Ozcelik B, Saner S. Review of Methods to Determine Antioxidant Capacities. Food Anal Methods 2009; 2:41-60].

Debido a la dificultad de medir todos los antioxidantes de una muestra por separado, esta determinación es muy útil por ser los resultados obtenidos más representativos de la capacidad antioxidante total que la determinación de todos los antioxidantes de la muestra de forma individual, ya que considera las posibles interacciones entre los distintos antioxidantes presentes. Además, la determinación de la capacidad antioxidante total es mucho más sencilla que la determinación de todos los antioxidantes de la muestra por separado.

Sin embargo, el principal antioxidante presente en muestras biológicas, el ácido úrico (AU), está en una concentración muy superior a la del resto de antioxidantes y presenta una contribución relativa muy elevada de la capacidad antioxidante total. De hecho, la capacidad antioxidante total correlaciona altamente con los niveles de ácido úrico presentes en las muestras biológicas (plasma, orina, etc.). Ya que los niveles de ácido úrico están alterados en multitud de patologías, también después de realizar ejercicio físico o incluso por un estrés oxidativo elevado, los resultados de capacidad antioxidante total obtenidos con los métodos actuales pueden llevar a resultados inesperados y a errores de interpretación. Por ello, la determinación de la capacidad antioxidante sin la contribución relativa del ácido úrico es una determinación mucho más relevante para el estudio del estatus antioxidante y el estrés oxidativo en estudios experimentales, epidemiológicos o clínicos que la proporcionada por los métodos actuales de determinación de capacidad antioxidante total.

Existen algunos trabajos publicados en los que se hace referencia a la determinación de capacidad antioxidante sin la contribución relativa del ácido úrico. El más reciente es una publicación de nuestro grupo de investigación [Campos C, Guzmán R, López-Fernández E, Casado A. Urinary uric acid and antioxidant capacity in children and adults with Down syndrome. Clin Biochem 2010; 43:228-233], en la que se determina la capacidad antioxidante sin la contribución relativa de ácido úrico, pero ésta se realiza mediante una determinación indirecta en la que, además, se consideran las posibles interacciones que pudiera tener el ácido úrico puesto que éste no se eliminaba de la muestra. Anteriormente hay una publicación [Chen J, Lindmark-M\ring{a}nsson H, Gorton L, Åkesson B. Antioxidant capacity of bovine milk as assayed by spectrophotometric and amperometric methods. International Dairy Journal 2003; 13:927-935], donde se emplea uricasa para degradar el ácido úrico y luego determinan la capacidad antioxidante sin la contribución del ácido úrico utilizando el ensayo TEAC. Posteriormente, existen dos publicaciones [Nälsén C, Öhrvall M, Kamal-Eldin A, Vessby B. Plasma antioxidant capacity among middle-aged men: The contribution of uric acid. Scand J Clin Lab Invest 2006; 66:239-248; Nälsen C, Vessby B, Berglund L, et al. Dietary (n-3) fatty acids reduce plasma F₂-Isoprostanes but not prostaglandin F_2α in healthy humans. J Nutr 2006; 136:1222-1228] del mismo grupo de investigación en las que también se utiliza uricasa para degradar el ácido úrico de la muestra y posteriormente se determina la capacidad antioxidante sin la contribución del ácido úrico mediante quimioluminiscencia.

Teniendo en cuenta que la degradación de ácido úrico con uricasa produce peróxido de hidrógeno, el cual puede interferir en la medida posterior de capacidad antioxidante dado que puede actuar como oxidante o como antioxidante, la presente invención incluye la novedad de tratar la muestra con catalasa para eliminar la interferencia del peróxido de hidrógeno. Por otra parte, en ninguna de las metodologías citadas anteriormente se utiliza un tampón adecuado para la degradación del ácido úrico por la uricasa, y no aseguran la completa degradación de éste.

Por lo tanto se plantea la necesidad de desarrollar nuevos métodos que subsanen las deficiencias anteriormente mostradas y que permitan determinar la capacidad antioxidante de muestras biológicas, sin la contribución del ácido úrico o del peróxido de hidrógeno.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo método para la determinación de la concentración y de la contribución antioxidante del ácido úrico en muestras, ya sean biológicas, en muestras procedentes de la industria alimentaria, en cosméticos... que muestra la novedad de tratar la muestra con las enzimas uricasa y catalasa para eliminar la contribución del ácido úrico y del peróxido de hidrógeno, presentes en las muestras biológicas. Además se emplea un pH óptimo tanto para la uricasa como para la catalasa. Así mismo, este pH es también adecuado para la reacción que tiene lugar en la determinación posterior de capacidad antioxidante. Además, la presente invención permite valorar no solo la capacidad antioxidante del ácido úrico si no también, y de forma simultánea, la capacidad antioxidante sin la contribución del ácido úrico, la capacidad antioxidante total y la concentración del propio ácido úrico.

Por lo tanto un primer aspecto esencial de la presente invención, se refiere a un método para valorar la capacidad antioxidante del ácido úrico de una muestra (Figura 1), que comprende las siguientes etapas:

Según una realización preferida, las muestras son mezcladas con BCS (2,9-dimetil-4,7-difenil-1,10-fenantrolindisulfónico) en disolución tampón TRIS y se agita en Vortex. La cantidad a mezclar de BCS es de 200 a 400 μL, preferiblemente de 300 μL y a una concentración de 0,5 a 3 mM, preferiblemente de 1,5 a 2,5 mM, más preferiblemente de 2 mM.

Según otra realización preferida, el tampón TRIS es de 0,05 M a 1 M, preferiblemente de 0,1 a 0,5 M, más preferiblemente de 0,1 M a un pH de 8,4 a 9,0, más preferiblemente de 8,5.

Según otra realización preferida, la muestra se selecciona del grupo formado por orina, líquido cefalorraquídeo, plasma, suero, sudor, saliva, muestra cosmética, bebidas, alimentos, entre otras y cada alícuota tiene un volumen de partida de 50 a 100 μL, preferiblemente de 60 a 85 μL y más preferiblemente de 75 μL.

Según otra realización preferida, se adicionan a la alícuota (I) y (II) de 50 a 100 μL de la enzima catalasa, preferiblemente 75 μL, preparada con agua destilada... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar la concentración y la contribución antioxidante del ácido úrico de una muestra, que comprende las siguientes etapas:

2. El método según la reivindicación 1, donde las muestras son mezcladas con BCS en disolución tampón TRIS.

3. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde la cantidad a mezclar de BCS es de 200 a 400 μL, preferiblemente de 300 μL y a una concentración de 0,5 a 3 mM, preferiblemente de 1,5 a 2,5 mM, más preferiblemente de 2 mM.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el tampón TRIS tiene una concentración de 0,05 M a 1 M, preferiblemente de 0,1 a 0,5 M, más preferiblemente de 0,1 M a un pH de 8,4 a 9,0, más preferiblemente de 8,5.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la muestra se selecciona del grupo formado por orina, líquido cefalorraquídeo, plasma, suero, sudor, saliva, muestra cosmética, alimentos y bebidas.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde las alícuotas (I) y (II) tienen un volumen de muestra de partida de 50 a 100 μL, preferiblemente de 60 a 85 μL y más preferiblemente de 75 μL.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde se adicionan a la alícuota (I) y (II) de 50 a 100 μL de la enzima catalasa, preferiblemente 75 μL, preparada con agua destilada a una concentración de 50 a 1000 U/mL, preferiblemente de 100 U/mL.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde se adicionan a la alícuota (I) de 100 a 200 μL, preferiblemente 150 μL, de la enzima uricasa preparada con tampón TRIS 0,1 M pH 8,5 a una concentración de 0,8 a 4 U/mL, preferiblemente de 1 U/mL.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde se adicionan a la alícuota (II) de 100 a 200 μL, preferiblemente 150 μL, de una disolución tampón TRIS 0,1 M pH 8,5.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la etapa de determinar la capacidad antioxidante sin la contribución del ácido úrico de la alícuota (I) y la etapa de determinar la capacidad antioxidante total de la alícuota (II), comprenden ambas las siguientes sub-etapas:

11. El método según la reivindicación 10, donde las lecturas espectrofotométricas se hacen en un rango de longitudes de onda de 480 a 495 nm, preferiblemente a 490 nm.

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, donde se adicionan de 10 a 100 μL de una solución de sulfato de cobre, preferiblemente de 30 a 60 μL, más preferiblemente de 50 μL, de concentración de 2 a 8 mM, preferiblemente de 3 a 6 mM, más preferiblemente de 4 mM.

13. El método según la reivindicación 12, donde el sulfato de cobre se deja incubar de 1 a 5 minutos, preferiblemente 3 minutos, a temperatura ambiente.

14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, donde la reacción se para con un agente quelante, preferiblemente EDTA en una cantidad de 10 a 80 μL, preferiblemente de 40 a 60 μL, más preferiblemente a 50 μL, a una concentración de 0,01 a 0,5 mM, preferiblemente de 0,01 a 0,1 mM, más preferiblemente de 0,01 mM.

15. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde la contribución antioxidante del ácido úrico de una muestra se determina mediante la diferencia entre la capacidad antioxidante total y la capacidad antioxidante sin la contribución del ácido úrico.

16. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde la concentración del ácido úrico de una muestra se determina extrapolando el resultado de la diferencia entre la capacidad antioxidante total y la capacidad antioxidante sin la contribución del ácido úrico en una curva de calibrado obtenida con ácido úrico.