Método para modificar la morfología, bioquímica y fisiología de plantas que comprende la expresión de citoquinina oxidasa de plantas.

Un método para incrementar el tamaño o peso de las semillas que comprende incrementar el nivel o actividad deuna citoquinina oxidasa en las semillas en una planta.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E07113288.

Solicitante: SCHMULLING, THOMAS.

Inventor/es: SCHMULLING,THOMAS, Werner,Tomás.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/82 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para células vegetales.
  • C12N9/06 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre compuestos que contienen nitrógeno como dadores (1.4, 1.5, 1.7).

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Fragmento de la descripción:

Método para modificar la morfología, bioquímica y fisiología de plantas que comprende la expresión de citoquinina oxidasa de plantas

Campo de la invención

La presente invención se relaciona en general con métodos para modificar propiedades o características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas de plantas, tales como uno o más procesos de desarrollo y/o procesos de adaptación ambiental, incluyendo desarrollo de semillas. Los métodos para incrementar el tamaño y/o peso de semillas, incrementar el tamaño y/o peso de los embriones, e incrementar el tamaño y/o peso de los cotiledoneos también se proveen aquí. Los métodos comprenden expresar una proteína de control de la degradación de la citoquinina, en particular la citoquinina oxidasa, en la planta, operablemente bajo el control de una secuencia promotora regulable tal como una secuencia promotora específica de células, promotora específica de tejidos o promotora específica de órganos. Preferiblemente, las características modificadas por la presente invención son características mediadas por la citoquinina y/o mediadas por la auxina.

Antecedentes de la invención

Las raíces son un órgano importante de las plantas superiores. Sus funciones principales son anclar la planta al suelo y absorber agua y nutrientes (nutrición N, minerales, etc.) Así, el crecimiento de las raíces tiene una influencia directa o indirecta sobre el crecimiento y rendimiento de los órganos aéreos, en particular bajo condiciones de limitación de nutrientes. Las raíces también son relevantes para la producción de productos secundarios de las plantas, tales como compuestos defensivos y hormonas vegetales.

Las raíces también son órganos de almacenamiento en un cierto número de cultivos de consumo importantes. La remolacha de azúcar es la planta más importante para la producción de azúcar en Europa (260 Millones de toneladas/año, 38% de la producción mundial) . La mandioca (casaba) , ñames y patatas dulces (batatas) son productores importantes de almidón (aproximadamente 150 Millones de toneladas/cada año) . Su contenido de almidón puede ser dos veces más alto que el de la patata. Las raíces también son el órgano relevante para el consumo en un cierto número de vegetales (por ejemplo, zanahorias, rábanos) , hierbas (por ejemplo, jengibre, cúrcuma) y plantas medicinales (por ejemplo, ginseng) . Además, algunos de los productos vegetales secundarios encontrados en las raíces son de importancia económica para la industria química y farmacéutica. Un ejemplo es el ñame, el cual contiene moléculas básicas para la síntesis de hormonas esteroidales. Otro ejemplo es shikonina, la cual se produce en las raíces de la Lithospermum er y throrhizon en cultivos de raíces vellosas. La shikonina se utiliza por sus propiedades antiinflamatorios, antitumorales y para curación de heridas.

Además, el crecimiento mejorado de las raíces de plantas de cultivo también potenciará la competitividad con malezas y mejorará el crecimiento en áreas áridas, incrementando la accesibilidad y absorción de agua.

El crecimiento mejorado de las raíces también el relevante para propósitos ecológicos, tales como la biorremediación y prevención/detención de la erosión del suelo.

La arquitectura de las raíces es un área que ha permanecido largamente inexplorada a través de los cruces clásicos, por las dificultades de establecer esta característica en el campo. Así, la biotecnología podría tener un impacto significativo en la mejora de estas características, porque no se basa en selecciones a gran escala en el campo. Al contrario, las metodología biotecnológicas requieren un entendimiento básico de los componentes moleculares que determinan una característica específica de la planta. Hoy, este conocimiento es sólo fragmentario, y como consecuencia, la biotecnología hasta ahora ha sido incapaz de generar un cambio en esta área.

Un regulador bien establecido del crecimiento de las raíces es la auxina. La aplicación de ácido indol-3-acético (IAA) a plantas en crecimiento estimula el desarrollo de las raíces laterales y la elongación lateral de las raíces (Torrey, Am J Bot 37: 257-264, 1950; Blakely et al., Bot Gaz 143: 341-352, 1982; Muday and Haworth, Plant Physiol Biochem

32: 193-203, 1994) . Raíces expuestas a un rango de concentraciones de IAA inciciaron números crecientes de raíces laterales. (Kerk et al., Plant Physiol, 122: 925-932, 2000) . Además, cuando las raíces que han producido laterales en respuesta a una concentración particular de auxina exógena fueron expuestas subsecuentemente a una concentración más alta de IAA, se formaron numerosas raíces laterales supernumerarias espaciadas entre las ya existentes (Kerk et al., Plant Physiol, 122: 925-932, 2000) . Por el contrario, el crecimiento de las raíces sobre agar que contenía inhibidores de para el transporte de la auxina incluyendo NPA, disminuye el número de raíces laterales (Muday and Haworth, Plant Physiol Biochem 32: 193-203, 1994) .

Se han aislado mutantes de arabidopsis que contienen inhibidores incrementados de IAA endógeno (Boerjan et al., Plant Cell 7: 1405-141, 1995; Celenza et al., Gene Dev 9: 2131-2142, 1995; King et al., Plant Cell 7: 2023-2037, 1995; Lehman et al., Cell 85: 183-194, 1996) . Son conocidos por ser alelos de locus individuales localizados en el cromosoma 2. Estas plantas mutantes tienen raíces adventicias y laterales en exceso, lo cual está de acuerdo con los efectos antes descritos de la aplicación externa de auxina.

Los efectos estimuladores de las auxinas sobre la formación de raíces adventicias y laterales sugiere que la sobreproducción de auxinas en las plantas transgénicas es una estrategia válida para incrementar el crecimiento de las raíces. Aún así, es también cuestionable si esto produciría un producto comercial con características mejoradas. Aparte de su efecto estimulador sobre la formación de raíces adventicias y laterales, la sobreproducción de auxina dispara otros efectos, tales como la reducción en el número de hojas, morfología anormal de las hojas (hojas estrechas, rizadas) , inflorescencias abortados, dominio incrementado apical, formación de raíces adventicias en el tallo, la mayoría de los cuales son indeseables desde una perspectiva agronómica (Klee et al., Genes Devel 1: 8696, 1987; Kares et al., Plant Mol Biol 15: 225-236, 1990) . Por lo tanto, el problema principal con la metodología que se basa en la síntesis de auxina incrementada es un problema de control, es decir confinar los efectos de la auxina a la raíz. Este problema de control no ha sido superado probablemente utilizando promotores específicos para tejidos: las auxinas son transportados en la planta y su acción consecuentemente no está confinada al sitio de síntesis. Otro aspecto es si las auxinas siempre potenciarán la biomasa de la raíz total. Para plantas cultivadas en agar, se ha notado que el incremento de las concentraciones estimuló progresivamente la formación de raíces laterales pero concurrentemente inhibió el crecimiento de estas raíces (Kerk et al., Plant Physiol, 122: 925-932, 2000) .

Las semillas son la unidad reproductiva de las plantas superiores. Las semillas de las plantas contienen compuestos de reserva para asegurar la nutrición del embrión después de la germinación. Estos órganos de almacenamiento contribuyen significativamente a la nutrición humana así como a la alimentación animal. Las semillas consisten de tres partes principales, a saber el embrión, el endospermo y la cubierta de la semilla. Los compuestos de reserva están depositados en el órgano de almacenamiento el cual es bien sea el endospermo (resultante de doble fertilización, por ejemplo en todos los cereales) , el así llamado perispermo (derivado del tejido de las nucelas) o los cotiledones (por ejemplo, variedades de judías) . Los compuestos de almacenamiento son lípidos (colza de aceite) , proteínas (por ejemplo, en el aleurón de los cereales) o hidratos (almidón, oligosacáridos como la rafinosa) .

El almidón es el compuesto de almacenamiento en las semillas de los cereales. Las especies más importantes de maíz (producción anual cercana a 570 millones de toneladas; de acuerdo con FAO 1995) , arroz (540 millones de toneladas por año) y trigo (530 millones de toneladas por año) . Las semillas ricas en proteínas son diferentes clases de judías (Phaseolus spec., Vicia faba, Vigna spec.; cerca de 20 millones de toneladas por año) , guisantes (Pisum sativum; 14 millones de toneladas por año)... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para incrementar el tamaño o peso de las semillas que comprende incrementar el nivel o actividad de una citoquinina oxidasa en las semillas en una planta.

2. Un método para incrementar el tamaño o peso de los embriones que comprende incrementar el nivel o actividad de una citoquinina oxidasa en semillas en una planta, preferiblemente en embriones.

3. Un método para incrementar el tamaño de los cotiledones que comprende incrementar el nivel o actividad de una citoquinina oxidasa en cotiledones en una planta.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 para incrementar el tamaño o peso de una semilla que comprende la expresión de un ácido nucleico seleccionado del grupo consistente de:

(a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34,

(b) un ácido nucleico que comprende las secuencias de ARN correspondientes a cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34,

(c) un ácido nucleico que hibrida específicamente al complemento de un ácido nucleico tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34,

(d) un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que comprende el polipéptido como se da en SEQ ID NO: 32 y el cual es al menos 70% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 4,

(e) un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos la cual es al menos 47% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 6,

(f) un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos la cual es al menos 47% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 10 o 35,

(g) un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 2, 6, 8, 10, 12, 32 o 35,

(h) un ácido nucleico el cual es degenerado a un ácido nucleico tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 33 o 34 o el cual es degenerado a un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (g) como resultado del código genético,

(i) un ácido nucleico el cual es divergente de un ácido nucleico que codifica una proteína tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 2, 6, 8, 10, 12 o 35 o el cual es divergente de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (g) debido a las diferencias en la utilización de codones entre los organismos,

(j) un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en SEQ ID NOs: 4, 2, 6, 8, 10, 12 o 35, o un ácido nucleico como se define en (a) a (g) el cual es divergente debido a las diferencias entre alelos,

(k) un ácido nucleico que codifica un fragmento funcional de una citoquinina oxidasa codificada por un ácido nucleico tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34, o un fragmento funcional de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (j) , en donde dicho fragmento tiene la actividad biológica de una citoquinina oxidasa,

(l) un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (k) caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADn, ADNc, ADN genómico o ADN sintético, o ARN donde T es reemplazado por U.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 para incrementar el tamaño o peso de un embrión el cual comprende la expresión de un ácido nucleico seleccionado del grupo consistente de.

(a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34,

(b) un ácido nucleico que comprende las secuencias de ARN correspondientes a cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34,

(c) un ácido nucleico que hibrida específicamente al complemento de un ácido nucleico tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34,

(d) un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que comprende el polipéptido como se da en SEQ ID NO: 32 y el cual es al menos 70% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 4,

(e) un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos la cual es al menos 47% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 6,

(f) un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos la cual es al menos 47% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 10 o 35,

(g) un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 2, 6, 8, 10, 12, 32 o 35,

(h) un ácido nucleico el cual es degenerado a un ácido nucleico tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 33 o 34 o el cual es degenerado a un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (g) como resultado del código genético,

(i) un ácido nucleico el cual es divergente de un ácido nucleico que codifica una proteína tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 2, 6, 8, 10, 12 o 35 o el cual es divergente de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (g) debido a las diferencias en la utilización de codones entre los organismos,

(j) un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en SEQ ID NOs: 4, 2, 6, 8, 10, 12 o 35, o un ácido nucleico como se define en (a) a (g) el cual es divergente debido a las diferencias entre alelos,

(k) un ácido nucleico que codifica un fragmento funcional de una citoquinina oxidasa codificada por un ácido nucleico tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34, o un fragmento funcional de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (j) , en donde dicho fragmento tiene la actividad biológica de una citoquinina oxidasa,

(l) un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (k) caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADN, ADNc, ADN genómico o ADN sintético, o ARN donde T es reemplazado por U.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 3 para incrementar el tamaño de un cotiledón el cual comprende la expresión de un ácido nucleico seleccionado de acuerdo con el grupo consistente de:

(a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34,

(b) un ácido nucleico que comprende las secuencias de ARN correspondientes a cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34,

(c) un ácido nucleico que hibrida específicamente al complemento de un ácido nucleico tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34,

(d) un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que comprende el polipéptido como se da en SEQ ID NO: 32 y el cual es al menos 70% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 4,

(e) un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos la cual es al menos 47% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 6,

(f) un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos la cual es al menos 47% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 10 o 35,

(g) un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 2, 6, 8, 10, 12, 32 o 35,

(h) un ácido nucleico el cual es degenerado a un ácido nucleico tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 33 o 34 o el cual es degenerado a un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (g) como resultado del código genético,

(i) un ácido nucleico el cual es divergente de un ácido nucleico que codifica una proteína tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 2, 6, 8, 10, 12 o 35 o el cual es divergente de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (g) debido a las diferencias en la utilización de codones entre los organismos,

(j) un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en SEQ ID NOs: 4, 2, 6, 8, 10, 12 o 35, o un ácido nucleico como se define en (a) a (g) el cual es divergente debido a las diferencias entre alelos,

(k) un ácido nucleico que codifica un fragmento funcional de una citoquinina oxidasa codificada por un ácido nucleico tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34, o un fragmento funcional de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (j) , en donde dicho fragmento tiene la actividad biológica de una citoquinina oxidasa,

(l) un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (k) caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADn, ADNc, ADN genómico o ADN sintético, o ARN donde T es reemplazado por U.

7. El método de la reivindicación 4 en donde el ácido nucleico está bajo control de un promotor que controla la expresión preferencialmente en semillas.

8. El método de la reivindicación 5 en donde el ácido nucleico está bajo el control de un promotor que controla la expresión preferencialmente en embriones.

9. El método de la reivindicación 6 en donde el ácido nucleico está bajo el control de un promotor que controla la expresión preferencialmente en cotiledones.

10. El método de la reivindicación 7 en donde el promotor es específico adicionalmente al endosperma o aleurona.

11. El método de la reivindicación 4 donde dicho método lleva a un incremento en crecimiento de plantones o un incremento en el vigor temprano.

12. El método de la reivindicación 5 en donde dicho método lleva a un incremento en el crecimiento de los plantones

o a un incremento en el vigor temprano.

13. El método de la reivindicación 6 en donde dicho método lleva a un incremento en crecimiento de plantones o un incremento en el vigor temprano.

14. El método de la reivindicación 11 en donde el incremento en el crecimiento de los plantones o el vigor temprano está asociado con una tolerancia incrementada al estrés.

15. El método de la reivindicación 12 en donde el incremento en crecimiento de los plantones o el vigor temprano está asociado con el incremento en la tolerancia al estrés.

16. El método de la reivindicación 13 en donde el incremento en crecimiento de los plantones o el vigor temprano está asociado con un incremento en la tolerancia al estrés.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 4, el cual comprende la expresión en una planta de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 5, 25, o 27 o un ortólogo de dicho ácido nucleico, en donde dicho ortólogo es específico para la especie de la planta.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 5, el cual comprende la expresión en una planta de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de SEC ID NOs: 1, 5, 25, o 27 o un ortólogo de dicho ácido nucleico, en donde dicho ortólogo es específico para la especie de la planta.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende la expresión en una planta de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de SEC ID NOs: 1, 5, 25, o 27 o un ortólogo de dicho ácido nucleico, en donde dicho ortólogo es específico para la especie de la planta.

20. El método de la reivindicación 17 en donde el ácido nucleico está bajo control de un promotor que controla la expresión preferencialmente en semillas.

21. El método de la reivindicación 18 en donde el ácido nucleico está bajo el control de un promotor que controla la expresión preferencialmente en embriones.

22. El método de la reivindicación 19 donde el ácido nucleico está bajo el control de un promotor que controla la expresión preferiblemente en cotiledones.

23. El método de la reivindicación 20 en donde el promotor es específico adicionalmente al endosperma o aleurona.

24. El método de la reivindicación 17 en donde dicho método lleva a un incremento en el crecimiento de plantones o un incremento en el vigor temprano.

25. El método de la reivindicación 18 en donde dicho método lleva a un incremento en el crecimiento de plantones o a un incremento en el vigor temprano.

26. El método de la reivindicación 19 donde dicho método lleva a un incremento en el crecimiento de plantones o a un incremento en el vigor temprano.

27. El método de la reivindicación 24 en donde el incremento en el crecimiento de los plantones o el vigor temprano está asociado con tolerancia incrementada al estrés.

28. El método de la reivindicación 25 en donde el incremento en crecimiento de plantones o vigor temprano está asociado con tolerancia incrementada al estrés.

29. El método de la reivindicación 26 donde el incremento en el crecimiento de plantones o el vigor temprano está 10 asociado con tolerancia incrementada al estrés.

Figura 1 Figura 2

Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Figura 11 Figura 12 Figura 13A Figura 13B Figura 13C Figura 13D Figura 13E Figura 14


 

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