Un método modificado mejorado para la fabricación a escala de producción de grandes lotes estériles de grado clínico de Poly-ICLC,

un complejo de RNA bicatenario de ácido polirriboinosínico-polirribocitidílico de alto peso molecular, poli-L-lisina de peso molecular bajo, y carboximetilcelulosa, que tiene mayor exactitud de suministro de fármaco en aplicaciones clínicas, y potencia biológica y actividad de inducción de interferón incrementadas en primates, que comprende los pasos de:

producir un RNA bicatenario de ácido polirriboinosínico-polirribocitidílico utilizando una solución de componente ácido poliinosínico en un proceso que comprende clarificar la solución de ácido poliinosínico por calentamiento a aproximadamente 35º C antes de esterilización por filtración;

añadir una solución de componente poli-L-lisina muy lentamente a una solución de componente carboximetilcelulosa durante un periodo de al menos 4 días, y mezclar durante todo el tiempo de mezcladura con energía suficiente para formar un torbellino y minimizar la formación de precipitado, seguido por adición del RNA bicatenario de ácido polirriboinosínico-polirribocitidílico, en donde la viscosidad de la carboximetilcelulosa se reduce por calentamiento a aproximadamente 35º C, pero no más de 40º C, a fin de hacer posible un torbellino satisfactorio mientras se realiza la mezcladura.

Método para la preparación de poly-ICLC y sus usos Campo y antecedentes de la invención.

Campo de la Invención La presente invención se refiere en general a métodos para producción de compuestos farmacéuticos, y más particularmente a ácido polirriboinosínico-polirribocitidílico estabilizado con polilisina y carboximetilcelulosa (Poly-ICLC) .

Información de Antecedentes

La invención descrita y reivindicada en esta memoria comprende un método mejorado para producir grandes lotes de Poly-ICLC final estéril adecuado para uso clínico con toxicidad reducida a niveles de dosis eficaces. El Poly-ICLC resultante puede utilizarse clínicamente para tratar diversas afecciones y para regular genes.

La Patente U.S. 4.349.538 (Hilton B LEVY) describe la preparación y el uso clínico de Poly-ICLC.

Sin embargo, las altas dosis (> 300 Ig/kg) descritas clínicamente por Levy tenían como finalidad inducir interferón y resultaron tóxicas y en gran parte ineficaces para tratamiento de pacientes humanos, hasta el punto que, después de muchos intentos, el uso clínico experimental de Poly-ICLC se interrumpió en gran parte hace más de una década. Así, más de 20 años después que fue descrito por primera vez, el Poly-ICLC no ha sido aprobado todavía por la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos para ninguna indicación terapéutica. El ácido poliinosínico-policitidílico estabilizado con polilisina y carboximetilcelulosa (Poly-ICLC) es un complejo sintético de ácido poliinosínico y ácido policitidílico (RNA bicatenario (dsRNA) ) , estabilizado con polilisina y carboximetilcelulosa que fue utilizado como inductor de interferón a dosis altas (hasta 300 Ig/kg IV) en pruebas de cáncer de corta dur ación hace algunos años. Esto dio resultados desiguales con toxicidad moderada, y el uso de Poly-ICLC fue abandonado por regla general cuando llegaron a estar disponibles los interferones recombinantes. Sin embargo, a dosis más baja (10 a 50 Ig/kg) Poly-ICLC da como resultado una estimulación más amplia de las defensas del hospedador, y una actividad clínica mejorada con poca o ninguna toxicidad. (Salazar, Levy et al. 1996) ) , (Ewel, Urba et al. 1992) (Levy and Bever 1988) (Levy and Salazar 1992) (Talmadge and Hartman 1985) . (Maluish, Reid et al. 1985)

Existen al menos cuatro acciones clínicas interrelacionadas de Poly-ICLC, cualquiera de las cuales (sola o en combinación) podría ser responsable de su actividad antitumoral y antiviral. Éstas son 1) su inducción de interferón; 2) su amplio efecto mejorador de la inmunidad; 3) su activación de enzimas específicas, especialmente oligoadenilatosintetasa (OAS) y la proteína-quinasa P68 (PKR) ; y 4) sus acciones reguladoras de genes multidimensionales.

Inducción de interferón. Si bien la inducción de interferón es uno de los mecanismos importantes para la acción de Poly-ICLC, el interferón por sí solo no parece ser tratamiento suficiente para muchas afecciones. Adicionalmente, los niveles de interferón sérico inducidos por las dosis de Poly-ICLC utilizadas por los presentes inventores son relativamente bajos y no han sido asociados en el pasado con acción antiviral o antitumoral cuando se administra exógenamente interferón solo.

Modulación de la inmunidad: El Poly-ICLC a dosis bajas tiene también una acción intensificadora de la inmunidad directa independiente de IFN que incluye la actinación de las células T y las células agresoras naturales, actinación de células dendríticas, liberación de citoquinas (v.g. interferones alfa, beta y gamma, interleuquinas, corticosteroides, y TNF) , y un potente efecto adyuvante con respuesta incrementada de anticuerpos al antígeno (Levy y Bever 1988) . Los efectos inmunoestimuladores de Poly-ICLC y los interferones son complejos. Sin embargo, resultados preliminares en laboratorio en el estudio piloto realizado por los inventores en pacientes con tumores cerebrales demostraron la ausencia de una relación clara entre la respuesta al tumor y el interferón sérico medible, TNF, IL2, IL6, o neopterina. (Salazar, Levy et al. 1996) . El efecto adyuvante de Poly-ICLC se ha demostrado también en varios sistemas. Por ejemplo, la administración en dosis bajas de Poly-ICLC junto con la vacunación contra la gripe de los cerdos en los monos acelera y aumenta espectacularmente los títulos de HAI. (Stephen, Hilmas et al. 1977) . Las complejas interacciones de los dsRNAs y los interferones en este contexto no están comprendidas todavía por completo, pero esta función dual aparentemente paradójica de Poly-ICLC como agente antiviral e intensificador de la inmunidad es consistente con su función en el establecimiento de un sistema inmediato de defensa contra el ataque viral al mismo tiempo que permite el establecimiento de inmunidad a largo plazo. Así, en contraste con los agentes antivirales convencionales tales como cidofovir, Poly-ICLC podría representar un adyuvante ideal en vacunas de virus vivos, especialmente aquéllas tales como la vacuna de la viruela que pueden llevar consigo una morbilidad importante relacionada con la proliferación del virus incontrolado de la vacuna. En contraste con la vacunación, se espera también que el efecto protector de dsRNAs tales como Poly-ICLC sea mucho más rápido, dado que el estado antiviral se establece en el transcurso de horas.

Acción "Catalítica" de Poly-ICLC: OAS y PKR

La tercera acción de Poly-ICLC es un efecto antiviral y antineoplástico más directo mediado por al menos dos sistemas mee enzimas nucleares inducibles por interferón, la 2'5'-oligoadenilato-sintetasa (OAS) y la P1/elF2a-quinasa, conocida también como la proteína-quinasa P68 dependiente de dsRNA (PKR) . (Katze 1992) , (Jacobs y Langland 1996) El dsRNA no es un componente normal de las células de mamífero, pero es un subproducto de muchas infecciones virales. El dsRNA induce un estado antiviral en las células por funcionar como un cofactor obligado para OAS, que activa la ribonucleasa-L, así como para la PKR, que inhibe la iniciación de la síntesis de proteínas, y para una aminotransferasa que está más incompletamente estudiada. Esto puede ayudar a la explicación de la disminución preferencial demostrada de la síntesis tumoral de proteínas in vivo por Poly-ICLC.

La OAS y la PKR son muy sensibles a la dosis y estructura del dsRNA (Minks, West et al 1979) . Por ejemplo, el dsRNA simple de cadena larga (como en Poly-ICLC) es el estimulador más potente de OAS y PKR, mientras que el dsRNA desapareado o irregular puede ser inhibidor. Análogamente, la PKR tiene a la vez sitios de fijación de afinidad alta y baja y es inhibida por una dosis excesivamente alta de dsRNA. (Galabru, Katze et al. 1989) . Clínicamente, la respuesta de OAS es también máxima a una dosis de aproximadamente 30 Ig/kg de Poly-ICLC, y se reduce notablemente porencima de 100 Ig/kg (M. Kende, N. Bernton, et al., no publicado) .

La inhibición de las células de glioma EFC2 in vitro por el interferón beta está asociada también significativamente con la activación tanto de OAS como de PKR. Otros investigadores han demostrado que la expresión de un mutante funcionalmente defectivo de la PKR da como resultado transformación maligna in vitro, lo que sugiere un papel importante para esta enzima en la supresión de la tumorigénesis. (Koromilas, Roy et al. 1992) . Se sabe ahora que tanto PKR como Poly-IC regulan el gen supresor de tumores p53, lo que está asociado a su vez con el síndrome de malignidad múltiple de Li Fraumeni, que incluye astrocitomas, sarcomas, y cánceres de pulmón y mama.

La semi-vida clínica de la respuesta de OAS a Poly-ICLC IM es aproximadamente 2, 5 días, lo que sugiere un programa de dosificación óptimo de dos o tres veces por semana (M. Kende, L. Bernton, et al., no publicado) . Pacientes tratados con Poly-ICLC exhibieron un aumento de hasta 40 veces en el producto OAS sérico en respuesta al tratamiento con 10 hasta 20 Ig/kg, y una asociación importante significativa de OAS sérico con la respuesta tumoral (p = 0, 03) . La mediación de la acción antitumoral por activación de OAS y/o PKR por OAS podría contribuir a explicar por qué razón las dosis altas de Poly-ICLC utilizadas en las pruebas iniciales de cáncer fueron relativamente ineficaces.

Muchos virus, con inclusión pero sin carácter limitante de adenovirus, poxvirus (vaccinia) , virus de la fiebre aftosa, gripe, hepatitis, poliovirus, herpes símplex, SV-40, reovirus, y el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) soslayan las defensas del hospedador por regular en sentido decreciente OAS y/o PKR, y este efecto puede... [Seguir leyendo]

1. Un método modificado mejorado para la fabricación a escala de producción de grandes lotes estériles de grado clínico de Poly-ICLC, un complejo de RNA bicatenario de ácido polirriboinosínico-polirribocitidílico de alto peso molecular, poli-L-lisina de peso molecular bajo, y carboximetilcelulosa, que tiene mayor exactitud de suministro de fármaco en aplicaciones clínicas, y potencia biológica y actividad de inducción de interferón incrementadas en primates, que comprende los pasos de:

producir un RNA bicatenario de ácido polirriboinosínico-polirribocitidílico utilizando una solución de componente ácido poliinosínico en un proceso que comprende clarificar la solución de ácido poliinosínico por calentamiento a aproximadamente 35º C antes de esterilización por filtración;

añadir una solución de componente poli-L-lisina muy lentamente a una solución de componente carboximetilcelulosa durante un periodo de al menos 4 días, y mezclar durante todo el tiempo de mezcladura con energía suficiente para formar un torbellino y minimizar la formación de precipitado, seguido por adición del RNA bicatenario de ácido polirriboinosínico-polirribocitidílico, en donde la viscosidad de la carboximetilcelulosa se reduce por calentamiento a aproximadamente 35º C, pero no más de 40º C, a fin de hacer posible un torbellino satisfactorio mientras se realiza la mezcladura.

2. El método de la reivindicación 1 en donde la evaporación debida al calentamiento se contrarresta por adición de agua estéril para inyección durante el proceso de mezcladura.

3. Poly-ICLC producido por un método de acuerdo con la reivindicación 1, para uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo constituido por tumores cerebrales malignos, melanoma, cáncer de mama y de pulmón, cáncer de colon, sarcomas, cáncer de células renales, leucemias, infecciones microbianas que incluyen gripe, infecciones de flavivirus, virus del Nilo Occidental, encefalitis japonesa, dengue, fiebre amarilla, coronavirustales como SARS, filovirus tales como el virus Ébola, gripe, poxvirus tales como vaccinia y viruela, adenovirus, hepatitis, infecciones de herpesvirus, HIV, SIDA, encefalitis de los equinos, virus de la fiebre aftosa, complejo respiratorio de los bovinos, virus del síndrome reproductivo-respiratorio de los porcinos, esclerosis múltiple, síndrome Guillain Barre, neuropatías inmunes, vasculitis y radiación ionizante, por administración del mismo por vía intranasal, oral, sublingual, intramuscular, intravenosa, transdérmica o tópica en al menos dos dosis espaciadas 4-72 horas en donde la primera dosis está comprendida en un intervalo moderado de 20 a 100 Ig/kg en humanos suficiente para inducir niveles medibles pero no excesivos de interferón sérico; y la segunda dosis, más baja, está comprendida en el intervalo de eficacia máxima de 10 a 50Ig/kg en humanos para desbloqueo y estimulación de cierto s sistemas enzimáticos inducibles por interferón y dsRNA, con inclusión de PKR y 2'5'OAS.

4. Poly-ICLC producido por un método de acuerdo con la reivindicación 1, para uso en el tratamiento de una enfermedad de acuerdo con la reivindicación 3 en donde los ciclos de dosis deben repetirse semanalmente o dos veces por semana durante meses a años.

5. Poly-ICLC producido por un método de acuerdo con la reivindicación 1, para uso en el mejoramiento de la acción y reducción de la toxicidad de una vacuna por administración del Poly-ICLC a un individuo, y administración de la vacuna deseada a dicho individuo.

6. Poly-ICLC producido por un método de acuerdo con la reivindicación 1, para uso en el mejoramiento de la acción de una vacuna contra la viruela de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Poly-ICLC producido por un método de acuerdo con la reivindicación 1, para uso en la regulación correctora de la expresión anormal de un gen codificante de helicasa, proteína inducida por interferón (p56) , factor de necrosis tumoral factor regulador del interferón, metaloproteinasa de la matriz, activador del plasminógeno, proteína tumoral p53, factor de crecimiento de fibroblastos, factor 2 de iniciación eucariota, proteína asociada con filamentos de actina, o VCAM-1 por administración de una dosis eficaz en el intervalo de 10-40 microgramos por kg de peso corporal a un paciente que se encuentra en necesidad de tratamiento, a fin de estimular la respuesta temprana innata del hospedador de dicho paciente, repitiéndose dicha dosis a intervalos d.

2. 72 horas.

Figura 1. Respuesta Sistémica a una Dosis Intranasal Simple de Poly-ICLC en Monos Rhesus Línea Base de Título de Interferón Título de interferón en Plasma a las Mono # en plasma (U. Intl.) 24 Horas (U. Intl.)

Figura 2. Inducción de Interferón en Monos Rhesus por 2 mg/kg IV de Poly-ICLC Como se Describe en la Presente Solicitud (Lote #RBP 1005) (Compárese con la Tabla II en Levy '82, Patente #4349538, Tratamiento con 3 mg/kg PICLC)

Figura 3. Test de Partículas (Claridad) de los Componentes de Poly-ICLC y Producto Final Como se Describe en la Presente Solicitud 10-25micrómetros > 25 micrómetros Componentes: Solución Poly I: 29, 4/ml 0, 9 Solución Poly C: 16/ml 1, 7 Solución de poli-lisina: 94, 8/ml 3, 4 Solución de carboximetilcelulosa: 199, 6/ml 40, 4 Poli-ICLC (método mejorado) 731/envase 110

Poli-ICLC (método antiguo) > 5.500 > 500

Tabla 4: Porcentaje de Supervivencia de los Pacientes de Glioma Maligno Tratados con Poly-ICLC

Supervivencia GBM AA AA (pf) 12 pacientes 11 pacientes 11 pacientes GBM = glioblastoma, AA = astrocitoma anaplástico, pf = supervivencia exenta de progresión, † = Supervivencia esperada durante el tratamiento estándar con radiación y quimioterapia.

Figura 5. Tratamiento con Poly-ICLC del SIDA, Carga Viral

34. D D D D PR-O4 0 -78 0 0 0 0 -PR-05 0 -------PR-06 200 -310 D D D D D PR-O7 - 34.

35. D D D D PR-O8 - 78 42 0 0 0 0 -04-056 12 .

57. D D D D PR-10 72 --0 0 0 --PR-11 8.

37. 0 0 0 --PR-12 7.

37. 0 0 0 --PR-13 85 -16 11 0 D D D PR-16 0 0 0 0 ----PR-24 0 0 0 0 ----PACIENTE Antigenemia P24 (pcg/ml) Número Base 4 meses 8 meses 12 meses 16 meses 20 meses 24 meses 30 meses PR-15 0 0 0 D D PR-17 0 0 0 0 -PR-18 0 -0 0 -PR-19 117 31 D D D PR-20 0 0 0 0 -PR-21 0 0 0 0 -PR-22 0 0 0 0 -PR-23 808 704 440 200 -"-" = No realizado

Figura 6. Tratamiento con Poly-ICLC de la Esclerosis Múltiple Progresiva EDSS-E = Registro del estado de discapacidad de Kurtzke a la entrada; EDSS-L = EDSS en el último examen; rango de EDSS desde 1 (MS moderada) a 9 (totalmente discapacitado) AI-E = índice de ambulación a la entrada en el estudio; AI-L = AI en el último examen AI varía desde 1 (discapacidad mínima) a 9 (postrado en cama)