MÉTODO PARA GENERAR ANTICUERPOS MONOCLONALES QUE RECONOCEN ANTÍGENOS DE MEMBRANA DE CÉLULAS PROGENITORAS NEURALES, ANTICUERPOS PRODUCIDOS POR DICHO MÉTODO, Y USOS.

Método para generar anticuerpos monocionales que reconocen antígenos de membrana de células progenitoras neurales,

anticuerpos producidos por dicho método, y usos.La presente invención se refiere a un método para generar anticuerpos monocionales que reconocen específicamente antígenos de membrana de célula progenitoras neurales, a los anticuerpos producidos por dicho método, entre ellos, los anticuerpos aquí denominados NILO1 y NILO2, y depositados en la autoridad internacional de depósito Deutsche Sammlung von Mlkroorganismen und Zeflkulturen GmbH (DSMZ), Braunschwelg, Alemania, con el número de acceso DSM No. ACC2887 y DSM No. ACC2881, respectivamente. Los anticuerpos obtenidos por el método de la invención, entre ellos NILO1 y NILO2, pueden emplearse en para identificar, aislar y enriquecer poblaciones en células progenitoras, incluyendo células progenitoras de sistema nervioso

Método para generar anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos de membrana de células progenitoras neurales, anticuerpos producidos por dicho método, y usos.

La presente invención se refiere al empleo de los anticuerpos monoclonales, denominados NILO1 y NILO2, que se unen a marcadores de superficie celular, con el fin de identificar, aislar y enriquecer poblaciones en células progenitoras, incluyendo células progenitoras del sistema nervioso central. También se refiere al método específico para obtener los anticuerpos, a una composición farmacéutica que contenga dichos anticuerpos y a sus usos, entre los que se incluye un método para identificar el efecto de una molécula o fármaco sobre poblaciones de células progenitoras.

Estado de la técnica anterior Con pocas excepciones, las poblaciones neuronales del sistema nervioso central (SNC) habían sido consideradas como esencialmente posmitóticas y diferenciadas, sin capacidad de ser reemplazadas tras su muerte. La confirmación de procesos de neurogénesis activa, principalmente en dos áreas del SNC adulto de todos los mamíferos (Altman and Das, 1965. J Comp Neurol 124: 319-35; Alvarez-Buylla et al., 2000. Prog Brain Res 127: 1-11; Bedard and Parent, 2004. Brain Res Dev Brain Res 151: 159-68; Bonnert et al., 2006. Eur J Neurosci; Lennington et al., 2003. Reprod Biol Endocrinol 1: 99) , sugiere un potencial del cerebro para regenerarse, incluyendo el cerebro humano. Esto ofrece un futuro prometedor para las terapias de reemplazo celular y, por lo tanto, para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, para las cuales todavía no se dispone de un enfoque terapéutico efectivo.

Las células madre neurales constituyen el origen de todas las células cerebrales, las neuronas y la glia. Las células de glia, inicialmente consideradas como células de soporte, incluyen a los astrocitos, células con forma estrellada e involucradas en diferentes funciones, y los oligodendrocitos, que rodean con mielina los axones de las neuronas para protegerlos. El número de células madre neurales es muy escaso en un cerebro adulto, aunque la neurogénesis se mantiene a lo largo de la vida en ratones y probablemente en humanos.

Las células madres neurales se concentran principalmente en unos nichos determinados del tejido nervioso central que son particularmente, la zona subventricular (SVZ) del ventrículo lateral (Doetsch et al., 1999. Cell 97: 703-16) y la zona subgranular del hipocampo, debajo del giro dentado. La zona subventricular telencefálica (SVZ) es la fuenteprincipal de células madre neuronales en ratones adultos, generando las neuronas del bulbo olfatorio (OB) (Álvarez-Buylla et al., 2000. Prog Brain Res 127: 1-11; Bedard et al., 2002. Eur J Neurosci 16: 1917-24; Doetsch et al., 2002. Neuron 36: 1021-34; Dutton and Bartlett, 2000. Dev Neurosci 22: 96-105; Pencea et al., 2001. Exp Neurol 172: 1-16) . La SVZ consiste en una lámina delgada de células proliferando activamente en la edad adulta, cubriendo las paredes de los ventrículos laterales. (Doetsch et al., 1999. Cell 97: 703-16) . Algunas de estas células progenitoras están concentradas en el cuerpo anterior del ventrículo, dando lugar a la vía migratoria rostral (RMS = rostral migrator y stream) .

Eventualmente las células madre neurales pueden también derivar del builbo olfatorio como resultado de la migración de las células subependimales por la vía migratoria rostral (Alvarez-Buylla y Lim, 2004. Neuron 41: 6836) . Estás áreas se definen como neurogénicas dada la posibilidad de obtener in vitro células capaces de mantener la autorenovación creciendo o en monoláminas sobre substrato recubierto de tejido o como agregados de células conocidos como neuroesferas. Las células madre neurales pueden proliferar y mantener la capacidad de autorenovación si crecen en el medio apropiado suplementado con EFG y FGF básico. La retirada de estos factores del medio provoca la diferenciación en los principales tipos neurales, neuronas y células de la glia (astrocitos y oligodendrocitos) .

De estas zonas proliferativas, se han aislado las células pluripotentes y se han clonado y expandido en cultivo. Bajo condiciones in vitro, o luego de ser transplantadas, estas células tienen la capacidad de generar los tres principales tipos celulares del sistema nervioso central y, por ello, son clasificadas como células pluripotentes neurales.

La sustitución funcional de poblaciones neuronales específicas mediante transplante de tejido neural representa una estrategia terapéutica atractiva para tratar enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, actualmente, las células madre neurales se obtienen a partir de tejido cerebral, mediante biopsia de tejido o necropsia, lo que plantea problemas éticos y de compatibilidad inmunológica. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de proporcionar una fuente de células madre neurales que supere los inconvenientes mencionados.

En este sentido, se conocen anticuerpos monoclonales que identifican células madres neurales utilizando antígenos presentes en el interior de la célula (antígenos intracitoplasmicos) , que tienen como inconveniente que no pueden ser utilizados para seleccionar poblaciones celulares viables, ya que requieren permeabilizar la membrana citoplásmica, con la consiguiente muerte celular, para que el anticuerpo pueda unirse a su antígeno que está en el interior de la célula. Existen muchos anticuerpos monoclonales intracitoplasmicos que caracterizan células precursoras neurales, como nestina, Sox2, Vimentina, o GFAP (para precursores muy inmaduros) y doblecortina, PSA-NCAM, Ki67, y tubulina β-III (para precursores proliferativos, y neuroblastos) , pero hasta la fecha solo se han caracterizado unos pocos anticuerpos frente a los antígenos de superficie de las células progenitoras neurales.

Se ha propuesto la perdida de tejido neural como la causa de de algunas patologías neuro-degenerativas que conllevan a una perdida progresiva de respuesta cerebral y la muerte del individuo. Hoy no existen tratamientos curativos de estas enfermedades y solo determinados tratamientos paliativos logran mejoras temporales de la enfermedad. Una de las razones de esta situación de cura temporal, es por la imposibilidad de suministrarles a estos enfermos mediante el transplante nuevas células madre neurales, una terapia celular que les permitiría regenerar, al menos en parte, el tejido dañado y mejorar su situación, probablemente de forma definitiva.

Pero hasta hoy ha sido prácticamente imposible obtener herramientas que permitan la purificación de células madre para su posterior enriquecimiento, selección y estudio o uso como agentes terapéuticos, lo que indica claramente la necesidad de encontrar nuevos marcadores de superficie contra las células neurales.

Explicación de la invención Existe, por tanto, la necesidad de encontrar una herramienta que permita la detección de células progenitoras para el enriquecimiento de poblaciones de células madre y precursores tempranos, lo que permitiría su estudio y uso como agentes terapéuticos.

En este sentido y de acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para generar anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente antígenos de membrana de células progenitoras que comprende:

a. Generación de neuroesferas que contengan células madre neurales (CMN) a partir del bulbo olfativo de un embrión de ratón de 13, 5 días de edad.

b. Inmunización de un hámster armenio macho de 4 meses de edad con células viables de neuroesferas

c. Obtención de los linfocitos mediante la extracción del bazo de dicho animal

d. Fusión de los linfocitos con células de mieloma no-productor de ratón, dando lugar a células híbridas o hibridomas

e. Determinación y/o selección de los anticuerpos producidos por los hibridomas mediante citometría de flujo de células de neuroesferas, donde las células muertas se excluyen del análisis, en presencia de ioduro de propidio.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona unos anticuerpos monoclonales, obtenidos por el procedimiento anterior, que comprenden:

a) el anticuerpo monoclonal, denominado NILO1 (clon 1 B6.2.13) , producido por el hibridoma depositado el 12 de marzo de 2008 con el número de acceso DSM No. ACC2887 en la autoridad internacional de depósito Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Braunschweig, Alemania, y cuya secuencia nucleotídica codificante de la cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 1, y la secuencia nucleotídica codificante... [Seguir leyendo]

1. Método para generar anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente antígenos de membrana de células progenitoras neurales que comprende:

a. generación de neuroesferas que contengan células madre neurales a partir del bulbo olfativo de un embrión de ratón de 13, 5 días de edad.

b. Inmunización de un hámster armenio macho de 4 meses de edad con células viables de neuroesferas

c. Obtención de los linfocitos mediante la extracción del bazo de dicho animal

d. Fusión de los linfocitos con células de mieloma no-productor de ratón pertenecen al ratón Balb.c dando lugar a células híbridas o hibridomas

e. Determinación y/o selección de los anticuerpos producidos por los hibridomas mediante citometría de flujo de células de neuroesferas en presencia de ioduro de propidio.

2. Anticuerpos monoclonales obtenibles por el método de la reivindicación 1, y caracterizados por:

a. Ser producido por el hibridoma depositado bajo el número de acceso DSM No. ACC2887 en la autoridad internacional de depósito Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Braunschweig, Alemania, y cuya secuencia nucleotídica codificante de la cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 1, y la secuencia nucleotídica codificante de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 2, ó

b. Ser producido por el hibridoma depositado bajo el número de acceso DSM No. ACC2881 en la autoridad internacional de depósito Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Braunschweig, Alemania, y cuya secuencia nucleotídica codificante de la cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 3, y la secuencia nucleotídica codificante de la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 4.

3. Fragmento/s inmunológicamente activos de cualquiera de los anticuerpos monoclonales según la reivindicación 2.

4. Construcción genética de ADN capaz de transcribirse a un anticuerpo/s o fragmento/s de anticuerpo/s de la invención, según cualquiera de las reivindicaciones 2-3.

5. Hibridomas productores de cualquiera de los anticuerpos monoclonales según la reivindicación 2, depositados bajo el número de acceso DSM No. ACC2887 y DSM No. ACC2881, en la autoridad internacional de depósito Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Braunschweig, Alemania.

6. Método para producir una población enriquecida en células progenitoras, que comprende:

a. Poner en contacto una población de células con un anticuerpo según la reivindicación 2, o un fragmento del mismo; y

b. seleccionar las células en las que existe un contacto entre el anticuerpo y dichas células.

7. Método según la reivindicación anterior, donde la población enriquecida en células progenitoras contiene células progenitoras neurales o células derivadas neurales.

8. Método según la reivindicación anterior, donde la población conteniendo células progenitoras neurales o células derivadas neurales se obtiene de un cultivo de neuroesferas.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, donde el anticuerpo según la reivindicación 2, o un fragmento del mismo se encuentra acoplado a marcadores como enzimas, cromóforos, materiales quimioluminiscentes, radionucleótidos o nanopartículas.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6-9, donde el anticuerpo según la reivindicación 2 se selecciona de una lista que comprende:

a. El anticuerpo según la reivindicación 2 (a) , o un fragmento del mismo.

b. El anticuerpo según la reivindicación 2 (b) , o un fragmento del mismo.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6-10 donde la selección de las células progenitoras se realiza mediante técnicas de citometría de flujo (incluyendo citometría de flujo FACS) o de microscopía, o utilizando técnicas de inmunocitoquímica (células) o inmunohistoquímica (tejido) , o por selección magnética o por cualquier otro método de selección positiva.

12. Población enriquecida de células madre o células progenitoras obtenible según el método de cualquiera de las reivindicaciones 6-11.

13. Uso de una población según la reivindicación anterior para la elaboración de un medicamento.

14. Uso de una población según la reivindicación 12 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de patologías degenerativas o que cursen con procesos de destrucción tisular.

15. Método de screening o descubrimiento de fármacos que comprende los siguientes pasos:

a. seleccionar de una población que contiene células madre o células progenitoras las que se unen a un anticuerpo según la reivindicación 2, oaun fragmento del mismo, y de este modo producir una población enriquecida para células madre,

b. inocular en un mamífero no humano dicha población enriquecida,

c. administrar una composición con potencial farmacéutico a dicho mamífero así como a otro mamífero no humano al que no se le ha inoculado la población descrita en la fase anterior (sujeto control) ; y

d. comparar el efecto de dicha administración entre ambos mamíferos.

16. Método de screening o descubrimiento de fármacos que comprende los siguientes pasos:

a. seleccionar de una población que contiene células madre o células progenitoras las que se unen al anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2 (a) , o un fragmento del mismo, y enriquecer más aún dicha población por selección adicional de las células que se unen al anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2 (b) , oaun fragmento del mismo, y de este modo producir una población enriquecida para células madre si se compara con la población de células original,

b. inocular en un mamífero no humano dicha población enriquecida para células madre o células progenitoras,

c. administrar una composición con potencial farmacéutico a dicho mamífero así como a otro mamífero no humano al que no se le ha inoculado la población descrita en la fase anterior (sujeto control) ; y

d. comparar el efecto de dicha administración entre ambos mamíferos.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15-16 donde el mamífero no humano es un roedor.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15-17 donde las células madre o células progenitoras son células madre neurales o células progenitoras neurales.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Consejo superior de Investigaciones Científicas (CSIC)

<120> Método para generar anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos de membrana de células progenitoras neurales, anticuerpos producidos por dicho método, y usos <130> ES1641.9

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 319

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Cadena pesada de Nilo1 (Heavy Chain secuencia parcial) . Región traducida a partir del nucleótido 174

<220>

<221> misc_feature <222> (5) .. (5)

<223> nisa, c, g, toru <220>

<221> misc_feature <222> (9) .. (9)

<223> nisa, c, g, toru <220>

<221> misc_feature <222> (12) .. (12)

<223> nisa, c, g, toru <220>

<221> misc_feature <222> (15) .. (15)

<223> nisa, c, g, toru <220>

<221> misc_feature <222> (230) .. (230)

<223> nisa, c, g, toru <220>

<221> misc_feature <222> (308) .. (308)

<223> nisa, c, g, toru

<400> 1

<210> 2

<211> 267

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cadena ligera de Nilo1 (light chain secuencia parcial) . Región traducida a partir del nucleótido 116)

<220>

<221> misc_feature

<222> (6) .. (6)

<223> nisa, c, g, toru

<220>

<221> misc_feature

<222> (8) .. (8)

<223> nisa, c, g, toru

<400> 2

<210> 3

<211> 222

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cadena pesada de Nilo2 (Heavy Chain secuencia parcial) . Región traducida a partir del nucleótido 87.

<220>

<221> misc_feature

<222> (4) .. (4)

<223> nisa, c, g, ort

<220>

<221> misc_feature <222> (11) .. (11)

<223> nisa, c, g, ort

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<221> misc_feature <222> (16) .. (16)

<223> nisa, c, g, ort

<220>

<221> misc_feature <222> (23) .. (23)

<223> nisa, c, g, ort

<400> 3

<210> 4

<211> 439

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Cadena ligera de Nilo2 (light chain secuencia parcial) . Región traducida a partir del nucleótido 171

<220>

<221> misc_feature <222> (2) .. (2)

<223> nisa, c, g, toru <220>

<221> misc_feature <222> (8) .. (8)

<223> nisa, c, g, toru <220>

<221> misc_feature <222> (10) .. (10)

<223> nisa, c, g, toru <220>

<221> misc_feature <222> (42) .. (42)

<223> nisa, c, g, toru <400> 4