Método histológico optimizado para la preservación de epítopos antigénicos y de la arquitectura celular de tejidos de vertebrados,

caracterizado porque combina la fijación por criosustitución y la inclusión en una cera o parafina de baja temperatura de fusión. El método objeto de la presente invención mejora la mayoría de los métodos histológicos actuales diseñados para microscopía óptica. Dicho método también mejora las propiedades antigénicas de tejidos embrionarios y adultos de anfioxo, Danio rerio y ratón, preservando su estructura y previniendo la degradación de ARN. Este método constituye una buena alternativa los métodos de histología clásica utilizados normalmente en estudios de embriogénesis de vertebrados frente a problemas tan comunes como la labilidad de epítopos o la intercalación de tejidos rígidos en tejidos blandos.

Método histológico optimizado para la preservación de epítopos antigénicos y de la arquitectura celular de tejidos de vertebrados.

Sector de la técnica

La presente invención se encuadra en el ámbito de la Histología, y más concretamente en el contexto de los métodos para la preservación y el mantenimiento de muestras histológicas de vertebrados.

Estado de la técnica

La preservación y el mantenimiento de la arquitectura celular y de la antigenicidad nativa durante el procesado histológico es un reto continuo de la Biología Celular. Durante los últimos diez años, se ha desarrollado el estudio de un buen número de organismos modelos útiles para el análisis experimental de muchos aspectos de la biología de los vertebrados, incluido su desarrollo (Haffter et al. 1996; Capdevila et al. 2000). La Biología del Desarrollo y otras disciplinas también requieren técnicas histológicas que permitan localizar tanto ARN mensajeros como proteínas en experimentos dirigidos a conocer la regulación y función génicas.

Las técnicas actuales más usadas son la fijación mediante paraformaldehído (PFA) seguida de crioprotección y secciones al criostato (Westerfield 2000) o inclusión en parafina y secciones al microtomo. Sin embargo, el PFA es mal un fijador de las propiedades reactivas de los tejidos, tales como la antigenicidad o la actividad enzimática.

En los casos de epítopos sensibles a los métodos más comunes de fijación se suelen usar fijadores de naturaleza alcohólica o de sales como el Zn. Estos, sin embargo, no ofrecen una apropiada preservación tisular y consecuentemente no permiten la obtención de secciones histológicas de buena calidad.

La presente invención supone una optimización de los métodos y técnicas conocidos en la actualidad, lo que se consigue mediante la combinación de la fijación por criosustitución (Hippe et al. 1989, Monaghan and Robertson. 1990, Quintana 1994 and Usuda et al. 1990) y la inclusión en una cera o parafina de baja temperatura de fusión, en torno a 40ºC, como por ejemplo la cera Polyester Wax (Steedman, 1957). La invención consiste en un método nuevo con el cual se logra una preservación óptima de la morfología y de las propiedades reactivas del tejido. Este método respeta la forma general de la muestra, eliminando los artefactos debidos a la retracción tisular.

Descripción detallada de la invención

El objeto de la presente invención es un nuevo método optimizado de preservación histológica e histoquímica que mejora las técnicas más utilizadas actualmente y ofrece una alternativa a los métodos clásicos. El método en cuestión es compatible con cualquier método de tinción de secciones histológicas, como la inmunolocalización o la hibridación in situ.

Por último, el proceso de fijación se combina con materiales de inclusión óptimos para la integridad tisular a la vez que sigue preservando la antigenicidad natural del tejido y reduce pasos del protocolo que aumentan la eficacia del proceso: La criosustitución implica la deshidratación inmediata de las muestras, lo que permite la eliminación de numerosos pasos de deshidratación que pueden alterar la integridad de las muestras; la cera o parafina de poliéster es soluble en alcoholes, lo que permite evitar el uso de solventes agresivos (por ejemplo, xileno) durante los pasos de desparafinado, siendo sustituibles por etanol 100º 0 ó 96º.

El método reivindicado comprende las siguientes fases o etapas:

Fijación por criosustitución

El método objeto de la presente invención comprende el uso de fijación alcohólica (criosustitución en metanol) efectuada a bajas temperaturas, muy efectivo para el mantenimiento de la antigenicidad. La fijación comprende el tratamiento de las muestras, adecuadamente preparadas, con isopentano y metanol.

La realización de dicho método comprende un soporte en columnas diseñado para la optimización del proceso y que son reivindicadas dentro de la misma invención. El solicitante no conoce la descripción de ningún mecanismo para preservar la forma de muestras criosustituidas. Las columnas reivindicadas, formadas por dos tubos de un material resistente a bajas temperaturas, permiten una sustitución sin contacto con objetos que evita que muestras blandas o con disposición definida se deformen por el soporte. Las columnas contienen, una de ellas, isopentano y, la otra, metanol, siendo el volumen de isopentano y de metanol preferentemente proporcional al volumen de la muestra. Las columnas son de tamaño variable, condicionado por el tamaño de la muestra. La longitud de la columna que contiene isopentano es proporcional el tiempo de sustitución en caída libre. Durante el hundimiento de la muestra, todo el contenido hídrico es sustituido por isopentano y, paralelamente, la muestra se congela. Por ello, el que este proceso ocurra durante la caída sin contacto con ningún instrumento, permite que la sustitución sea homogénea a través de toda su superficie y no se pierda la forma. Finalmente, la muestra llega al fondo, rígida por la congelación y deshidratada. Tras el tiempo requerido, la muestra es trasladada a la segunda columna, con metanol.

Inclusión en parafina de temperatura de fusión baja

Comprende la incubación de las muestras fijadas en diferentes soluciones (metanol:butanol 1:1, butanol, butanol:cera poliéster 1:1) a diferentes temperaturas, que van desde temperatura ambiente hasta 40ºC; y su solidificación en parafina poliéster.

Obtención de secciones

Comprende el uso de microtomo.

Montaje

Comprende el uso de agua destilada estéril.

Descripción de los dibujos

Figura 1. Efectos de varios fijadores en la preservación morfológica de los tejidos. Los tejidos fueron fijados, incluidos en Polyester Wax, y teñidos con la hematoxilina-picrosirio. A - H Secciones transversales de un embrión de Danio rerio de 72 h teñidas tras fijación por criosustitución (A), con PFA (B), con Bouin (C), con fijador de Zinc (D) y con MAA (E). F-H muestran respectivamente una ampliación de la región cuadrada de A-C. Las puntas de flecha (F) muestran el mesénquima subyacente al pliegue de la aleta. I-J: Secciones transversales de un adulto de anfioxo fijado por criosustitución (I) y PFA (J). La barra mide 50 μm.

Figura 2. Efecto de la fijación en la preservación antigénica. A y B: Secciones del músculo liso del esófago del ratón fijadas con PFA (C) o por criosustitución (D). Ambas secciones se tiñeron con el anticuerpo contra Mimecán-Osteoglicina. Las áreas positivas se muestran teñidas de rojo debido al fluorocromo Alexa Fluor 594 (inmunoflurorescencia indirecta). Los núcleos se muestran teñidos de azul debido a la tinción Hoescht. La punta de flecha señala un vaso sanguíneo. El asterisco señala una fibra muscular. Las barras miden 10 (C-D) y 20 μm (A-B). C y D: Uso de secciones obtenidas por nuestro método para diferentes metodología como la inmunolocalización e hibridación in situ. Secciones transversales de aleta regenerante (4 dpa). Tinción con anti-Zns-5, marcando escleroblastos o células sintetizadoras de lepidotriquias en rojo (Alexa Fluor 594; C). Hibridación in situ de una sección paralela marcando células que expresan colágeno 10 (D).

Figura 3. Representación esquemática de un protocolo de criosustitución diseñado para la preservación de la forma tridimensional. 1: Método para muestras grandes. 2: Método para muestras de tamaño pequeño, como podría ser un embrión de Danio rerio.

Figura 4. Sección de la extremidad anterior de un embrión de ratón (estadio E15.5) fijado por criosustitución e incluido en Polyester Wax. La sección fue teñida con el anticuerpo contra la PCNA y el Pro-colágeno. Los núcleos se tiñeron con Hoescht.

Modos de realización de la invención

Para validar el método objeto de la presente invención se han utilizado embriones y tejidos adultos de varias especies de cordados, numerosos anticuerpos primarios diferentes, específicos de diversos epítopos, y varias sondas génicas que han permitido conocer la localización de diversos ARN mensajeros de las distintas especies utilizadas. Los anticuerpos usados en las pruebas de optimización fueron marcados tanto con marcadores fluorescentes como con enzimas. Algunos anticuerpos específicos de epítopos muy lábiles, y que habían dado muchos problemas... [Seguir leyendo]

1. Método histológico optimizado para la preservación de epítopos antigénicos y de la arquitectura celular de tejidos de vertebrados que combina la fijación por criosustitución y la inclusión en una cera o parafina de baja temperatura de fusión caracterizado porque comprende las siguientes fases o etapas: