Método de obtención de embriones haploides y plantas doble-haploides de encina.

La presente invención describe un método de obtención de embriones haploides y plantas doble-haploides, de encina (Quercus ilex L) mediante embriogénesis gamética. El método consiste en la inducción de embriogénesis de las células gaméticas de la encina mediante un doble tratamiento de estrés y la obtención de embriones haploides y plantas doble-haploides. El primer tratamiento in vivo de estrés es un tratamiento en frío y se realiza en los amentos recogidos de las propias encinas. El segundo tratamiento in vitro de estrés consiste en un choque térmico al que se somete a las anteras extraídas de dichos amentos. Los embriones haploides pueden diploidizarse obteniéndose embriones doble-haploides, que son sometidos a un tratamiento específico para su maduración, germinación y crecimiento, dando lugar a plantas doble-haploides de encina

Método de obtención de embriones haploides y plantas doble-haploides de encina.

Campo de la invención La presente invención se basa en una aplicación de la biotecnología vegetal a la mejora genética de la encina (Quercus ilex L.) , dirigida a la obtención de embriones haploides y plantas doble-haploides homocigóticas puras (líneas puras) de encina mediante embriogénesis gamética.

Antecedentes Las especies forestales como la encina (Q. ilex L.) están sometidas a largos ciclos reproductivos que impiden la obtención de líneas puras mediante métodos convencionales, tales como retrocruzamientos.

Este hecho dificulta aún más la mejora genética clásica, ya de por sí lenta, puesto que se necesitan varios años para que las plantas alcancen la madurez sexual.

Por este motivo se ha buscado una alternativa válida para obtener líneas puras en una sola generación gracias a la producción de embriones haploides y plantas doble-haploides de encina, mediante embriogénesis gamética, que es el objeto de la presente invención.

En el estado de la técnica no existen evidencias de la obtención de individuos haploides y doble-haploides de encina, ni mediante técnicas de reproducción convencionales, como el retrocruzamiento, ni mediante la aplicación de técnicas novedosas de biotecnología.

En la patente española ES2180385 se describe un método para la obtención de embriones y plantas haploides de alcornoque, mediante técnicas biotecnológicas de inducción de embriogénesis gamética a partir de células gaméticas de alcornoque. La diferencia entre dicha patente y la presente invención, radica en que, aunque la encina y el alcornoque son especies procedentes de la misma familia, para que la embriogénesis gamética pueda producirse en la encina, se ha descubierto sorprendentemente que es necesario someter a las células gaméticas de la encina (microsporas) , a un doble pretratamiento de estrés que actúa como señal o estímulo para desencadenar el programa del desarrollo esporofítico en dichas microsporas, o lo que es lo mismo, desencadena el proceso de inducción de embriogénesis gamética en las mismas.

Es conocido en el estado de la técnica que para inducir embriogénesis gamética en las especies forestales en general y como queda detallado particularmente en la patente española mencionada anteriormente, ES218035, se suelen utilizar pretratamientos que se dan in vivo o in vitro tanto a botones florales enteros como a las propias anterasoalas microsporas y pueden ser tratamientos físicos, fisiológicos y químicos en forma de choque térmico (de frío o de calor) , ayuno (ausencia de azúcar o de nitrógeno en el medio) o tratamientos químicos en la escisión de espigas, anteras o microsporas. Una de las diferencias esenciales del método descrito en la invención reside en el doble pretratamiento, in vivo e in vitro, que es necesario llevar a cabo para que tenga lugar la embriogénesis de las células gaméticas de la encina y así obtener embriones haploides de encina. Por un lado, se realiza un tratamiento in vivo con frío, en los amentos recogidos del propio árbol de la encina y por otro lado, se realiza un tratamiento in vitro de choque térmico con calor, en las anteras extraídas de los amentos previamente sometidos a estrés, para inducir la embriogénesis gamética y obtener embriones haploides y plantas doble-haploides de encina. Otra diferencia esencial entre la patente española ES218035 y la presente invención radica en que en la patente española se describe un método para la obtención de embriones y plantas haploides, en cambio en la presente invención se describe un método novedoso para la obtención de embriones haploides y plantas doble-haploides, líneas puras, en una sola generación, que no se habían conseguido obtener hasta el momento, ni mediante métodos convencionales de retrocruzamiento, ni mediante la aplicación de novedosos métodos biotecnológicos. La obtención de líneas puras de encina mediante el método descrito en la presente invención, consigue que se disminuya el tiempo y los costes en el desarrollo de nuevos clones, además de proporcionar individuos con material genético “fijado”. Con este término se hace referencia a que en las especies agrícolas en general, se pueden obtener líneas puras mediante autofecundación forzada y continuada durante 7 o más años. Durante dicho proceso de autofecundación forzada, la segregación producida a través de los sucesivos cruzamientos y selección de individuos, hace que la forma homocigótica para la combinación génica deseada no se “fije”

o no se consiga en su totalidad. Sin embargo, mediante el método descrito en la presente invención, al obtenerse el embrión haploide directamente y de una sola vez, su duplicación hace que la homocigosis obtenida esté plenamente “fijada genéticamente”.

Además, la obtención de individuos haploides y doble-haploides de encina, mediante el método descrito en la presente invención, es ventajoso para la mejora genética de la especie, ya que la obtención de individuos homocigóticos facilitará la identificación de genes y proteínas y su estudio para conseguir individuos mejores genéticamente y mejor adaptados a las condiciones específicas del medio en el cual crezcan. Por otro lado, los individuos haploides y doblehaploides permiten realizar eficazmente estudios de mapeo genético en menor tiempo, centrándose en los caracteres de interés en cada estudio realizado. Los individuos haploides son también esenciales en la manipulación genética que se lleve a cabo en esta especie (transformación y estudios transgénicos) .

La encina es una de las especies más importantes del ecosistema forestal, la dehesa, del sur europeo. Es necesaria por tanto su conservación tanto desde el punto de vista medioambiental como para la economía rural. El pastoreo excesivo y el problema de la “seca” (infección debida a determinados hongos que ataca a los árboles produciéndoles la muerte) imposibilitan el relevo generacional en las dehesas. Las dehesas, como es conocido, son zonas preferentes de pastoreo del ganado porcino y los productos porcinos son altamente reconocidos a nivel mundial. La falta de regeneración de las dehesas y el problema de la “seca” pone en riesgo su futuro. En este sentido, la obtención de plantas doble-haploides mediante el método descrito en la presente invención, puede utilizarse en repoblación forestal e intentar paliarlos problemas mencionados.

Descripción de la invención Breve descripción de la invención La presente invención describe un método de obtención de embriones haploides de encina (Quercus ilex L.) a partir de células gaméticas (microsporas) , mediante embriogénesis gamética y que posteriormente son utilizados para la obtención de plantas doble-haploides homocigóticas puras (líneas puras) , aplicables a la mejora genética de la encina.

El método consiste en la inducción de la embriogénesis gamética en las microsporas de la encina mediante un doble tratamiento de estrés, inducido mediante choque térmico. En primer lugar, los amentos recogidos directamente de las encinas son sometidos a un primer tratamiento de estrés in vivo en frío, y en segundo lugar, las anteras extraídas de los amentos antes mencionados, son sometidas a otro tratamiento de estrés in vitro, mediante choque térmico por calor. Ambos pretratamientos inducen el proceso de embriogénesis de las células gaméticas, microsporas, que se encuentran en el interior de dichas anteras y la obtención de embriones haploides. Los embriones haploides obtenidos pueden diploidizarse dando lugar a embriones doble-haploides a los que se les somete posteriormente a un proceso de maduración, germinación y crecimiento, dando lugar a plantas doble-haploides, líneas puras, de encina. Estas plantas de encina, doble-haploides, son homocigóticas (líneas puras) y pueden utilizarse para la mejora genética de dicha especie.

A efectos de la presente invención se hacen constar los siguientes términos:

• Embriogénesis gamética: proceso mediante el cual las células gaméticas, en la presente invención, microsporas, como resultado de un tratamiento de estrés, cambian su programa de desarrollo gametofítico por un programa esporofítico, dando lugar a la formación de embriones haploides que posteriormente se pueden diploidizar, y obtener-plantas doble-haploides.

• Haploides: Individuos con un complemento cromosómico.

• Doble-haploides: Individuos con el mismo complemento cromosómico duplicado, por... [Seguir leyendo]

1. Método para la obtención de embriones haploides de encina que comprende: a) Recogida de amentos de encina durante el periodo de floración del árbol. b) Tratamiento in vivo en frío, de los amentos recogidos. c) Extracción aséptica de las anteras del interior de los amentos previamente tratados en el paso anterior. d) Tratamiento in vitro mediante cultivo en un medio de inducción de las anteras del paso anterior, por choque térmico. e) Mantener en cultivo las anteras del paso anterior hasta la aparición de los embriones haploides. f) Transferir los embriones haploides obtenidos en el paso anterior a un medio de proliferación.

2. Método para la obtención de embriones doble-haploides que consiste en llevar a cabo el método de la reivindicación 1 y, adicionalmente, someter a los embriones haploides obtenidos en la etapa f) a los siguientes pasos:

g) Cultivar en un medio de proliferación al que se añaden agentes antimitóticos los embriones haploides obtenidos en la etapa f)

h) Transferir los embriones doble-haploides obtenidos en el paso anterior a un medio de maduración y cultivarlos.

3. Método para la obtención de plantas doble-haploides que consiste en llevar a cabo el método de la reivindicación 2 y, adicionalmente, someter a los embriones doble-haploides obtenidos en la etapa h) a los siguientes pasos:

i) Someter a frío los cultivos de embriones doble-haploides maduros obtenidos en la etapa h) .

j) Transferir los embriones doble-haploides del paso anterior a un medio de germinación y cultivarlos hasta que germinen como plantas doble-haploides.

k) Transferir las plantas doble-haploides obtenidas en el paso anterior a recipientes adecuados para su crecimiento y aclimatación en invernadero.

4. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque el tratamiento in vivo en frío, de los amentos se realiza a una temperatura de 4 ± 2ºC y durante un tiempo de 7 ± 2 días.

5. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque las células gaméticas presentes en el interior de las anteras extraídas previamente de los amentos recogidos del árbol de encina, se encuentran en estadio uninucleado tardío o polen bicelular temprano.

6. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque el el tratamiento in vitro, mediante choque térmico de las anteras se realiza a una temperatura de 33 ± 2ºC durante un tiempo de 7 ± 2 días y en condiciones de oscuridad.

7. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque el cultivo en un medio de inducción de las anteras, hasta la aparición de embriones haploides, se realiza a una temperatura de 25ºC y durante un tiempo de 1 a 3 meses y en condiciones de oscuridad.

8. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque los embriones haploides obtenidos se cultivan en un medio de proliferación a una temperatura de 25ºC y en condiciones de oscuridad.

9. Método según la reivindicación 2 caracterizado porque los embriones doble-haploides se cultivan en medio de maduración durante un tiempo de 1 mes a una temperatura de 25ºC y en condiciones de oscuridad.

10. Método según la reivindicación 3 caracterizado porque la temperatura de frío a la que son sometidos los embriones doble-haploides es de 2 a 5ºC y durante un tiempo de al menos 2 meses.

11. Método según la reivindicación 3 caracterizado porque el cultivo de los embriones doble-haploides en medio de germinación se realiza a una temperatura de 25ºC y en condiciones de luminosidad.

12. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque el medio de inducción está formado por un medio de cultivo basal SM, carbón activo y una fuente de carbono.

13. Método según las reivindicaciones1º2 caracterizado porque el medio de proliferación está formado por un medio de cultivo basal SM, glutamina y una fuente de carbono.

14. Método según la reivindicación 2 caracterizado porque el medio de maduración está formado por un medio de cultivo basal SM, carbón activo y una fuente de carbono.

15. Método según la reivindicación 3 caracterizado porque el medio de germinación está formado por un medio de cultivo basal SM, hormonas de crecimiento y una fuente de carbono.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 caracterizado porque el medio de cultivo basal SM está formado por una solución de macronutrientes, una solución de micronutrientes, hierro quelado y cofactores, ajustándose el valor de pH entre 5.5-5.7.

17. Método según la reivindicación 16 caracterizado porque la solución de macronutrientes utilizada comprende: KCl a una concentración de entre 0, 30 a 0, 95 g/L, Cl2Ca.2H2O a una concentración de entre 0, 12 a 0, 15 g/L, SO4 (NH4) 2 a una concentración de entre 0, 13 a 0, 20 g/L, NO3KóNO3Na a una concentración de entre 0, 75 a 1, 00 g/L, SO4Mg.7H2O a una concentración de entre 0, 20 a 0, 31 g/L, PO4H2Na.H2O a una concentración de entre 0, 09 a 0, 15 g/L y PO4HNa2 a una concentración de 0, 03 g/L.

18. Método según la reivindicación 16 caracterizado porque la solución de micronutrientes utilizada comprende: BO3H3 a una concentración de 6, 200 mg/L, SO4Mn.H2O a una concentración de 16, 900 mg/L, SO4Zn.7H2O a una concentración de 10, 590 mg/L, IK a una concentración de 0, 830 mg/L, MoO4Na2.2H2O a una concentración de 0, 250 mg/L, SO4Cu.5H2O a una concentración de 0, 025 mg/L y Cl2CO.6H2O a una concentración de 0, 025 mg/L.

19. Método según la reivindicación 16 caracterizado porque el hierro quelado se añade en forma de Fe-EDTA.

20. Método según la reivindicación 16 caracterizado porque los cofactores empleados son: Piridoxina a una concentración de 5 μM, Tiamina a una concentración de 3 μM, Ácido ascórbico a una concentración de 10 μM, Ácido

nicotínico a una concentración de 10 μM, Glicina a una concentración de 10 μM e Inositol a una concentración de 250 μM.

21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 o 14 caracterizado porque el carbón activo se utiliza en una proporción de 1% (w/v) .

22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 caracterizado porque como fuente de carbono se utiliza sacarosa a una concentración de 90 mM.

23. Método según la reivindicación 15 caracterizado porque como fuente de carbono se utiliza sacarosa a una concentración de 30 mM.

24. Método según la reivindicación 13 caracterizado porque la concentración de glutamina utilizada es 500 mM.

25. Método según la reivindicación 2 caracterizado porque los agentes antimitóticos se seleccionan entre orizalina ó amiprofosmetil y se añaden a una concentración de 0.01 mM.

26. Método según la reivindicación 15 caracterizado porque las hormonas utilizadas son ácido 3-Indol-Butírico y 6-Bencilaminopurina

27. Método según la reivindicación 26 caracterizado porque el ácido 3 Indol-Butírico se añade a una concentración en el medio de cultivo de 0.1 mg/L y la 6-Bencilaminopurina se añade a una concentración en el medio de cultivo de

0.05 mg/L.

28. Embrión haploide de encina obtenible mediante el método descrito en la reivindicación 1, 4 a 8, 12, 13, 16 a 22 y 24.

29. Embrión doble-haploide de encina obtenible mediante el método descrito en las reivindicaciones 2, 9, 13, 14, 16 a 22, 24 y25.

30. Planta doble-haploide de encina obtenible mediante el método descrito en las reivindicaciones 3, 10, 11, 15 a 20, 23, 26 y 27.