Marcador fluorescente de muerte celular en el ojo.

Un marcador de muerte celular etiquetado con una etiqueta que tiene una longitud de onda dentro delespectro infrarrojo,

para uso en la identificación de muerte celular en el ojo, donde el marcador de muerte celular esuna anexina y la etiqueta es DY-776 que tiene la siguiente estructura:

Marcador fluorescente de muerte celular en el ojo

La invención se refiere al marcador para el uso en la visualización directa de muerte celular, en particular de la apoptosis en el ojo, especialmente la muerte de células individuales de células del nervio retiniano.

Las imágenes de células vivas se utilizan para detectar procesos celulares en ensayos in vitro de células cultivadas. Sin embargo, esto no ha sido aplicado previamente a nivel celular in vivo en el ojo. La pérdida de células nerviosas es un proceso que se produce en las primeras etapas de ciertos trastornos neurodegenerativos tales como el glaucoma, la retinopatía diabética y la enfermedad de Alzheimer. El glaucoma es la causa principal de ceguera irreversible en todo el mundo, que afecta al 2% de las personas mayores de 40. La enfermedad tiene una morbilidad significativa debido a su naturaleza silenciosa y progresiva, dando como resultado a menudo un retraso en el diagnóstico y el tratamiento. La enfermedad de Alzheimer es la forma más común de demencia que se prevé aumente pasando de afectar de 4 a 12 millones de estadounidenses en los próximos 20 años. Sería útil el ser capaces de valorar la apoptosis de células nerviosas en la retina para evaluar la progresión de enfermedades como el glaucoma, así como enfermedades degenerativas del cerebro.

Mediante la optimización de un marcador para detectar la muerte celular, de la administración del marcador y del aparato de formación de imágenes, que ha conducido al desarrollo de la tecnología, los inventores han sido capaces de demostrar que la visualización de apoptosis de células individuales en el ojo es posible. Los inventores han superado inconvenientes significativos, incluyendo la autofluorescencia intrínseca de la retina y los efectos negativos, tales como las respuestas inflamatorias al marcador.

Según la invención, se proporciona el uso de un marcador de muerte celular, en particular una anexina, conjugada con una etiqueta de longitud de onda optimizada, en particular DY-776, para la identificación de la muerte celular en el ojo. La etiqueta de longitud de onda optimizada desarrollada proporciona una calidad de imagen mejorada mediante la mejora de la relación señal-ruido y al mismo tiempo reduce el efecto tóxico asociado con otras etiquetas.

El citado marcador de muerte celular etiquetado puede utilizarse en un método para identificar o controlar la muerte celular en el ojo, que comprende la administración de un marcador de muerte celular etiquetado o conjugado con una etiqueta de longitud de onda optimizada para un sujeto y generar una imagen de la longitud de onda emitida desde el ojo del sujeto usando un dispositivo de imagen optimizado. Esto permite la cuantificación de la muerte celular a nivel de células individuales en el ojo en tiempo real.

El término “Muerte celular “se refiere a cualquier proceso incluyendo, por ejemplo, la muerte de una célula por apoptosis y necrosis, durante el cual hay pérdida de integridad de la membrana plasmática. El marcador de muerte celular etiquetado de la invención permite que las células que se están muriendo, por ejemplo por apoptosis, sean identificadas

En general el término "Marcador de muerte celular” se refiere a un marcador que permite distinguir a las células vivas de las células que están muriendo o han muerto. Por ejemplo puede ser un compuesto o molécula que se une específicamente a células vivas pero no a células muertas o que se están muriendo, o que se une específicamente a las células muertas o que se están muriendo, pero no a células vivas. Marcadores de muerte celular incluyen, por ejemplo, la familia de proteínas de la anexina. Las anexinas son proteínas que se unen reversiblemente a las membranas celulares en presencia de cationes. Las anexinas pueden ser naturales o recombinantes. Puede ser la proteína completa o puede ser un fragmento funcional, es decir un fragmento o porción de una anexina que se una específicamente a las mismas moléculas que la proteína completa. Además, los derivados funcionales de estas proteínas son marcadores de muerte celular. Se dispone de una gran variedad de anexinas, tales como las descritas en la solicitud de patente EE.UU. N º 2006/0134001 A. Una anexina preferida es anexina 5, que es bien conocida en el estado de la técnica. Otras anexinas que pueden ser utilizadas como marcadores de muerte celular incluyen las anexinas 11, 2 y 6. Se conocen otros marcadores de muerte celular especialmente de la apoptosis, en el estado de la técnica, entre los que se incluyen por ejemplo el yoduro de propidio y el dominio C2A de la sinaptotagmina [Jung et al., Bioconjing Chem. 2004 Sep-Oct; 15 (5) : 983-7]. El marcador de muerte celular utilizado en la presente invencion es una anexina

En general el término "etiqueta de longitud de onda optimizada" se refiere a una sustancia fluorescente, es decir una sustancia que emite luz en respuesta a la excitación, y que ha sido seleccionado para su uso debido a la alta relación señal-ruido y por lo tanto a una resolución y sensibilidad de imagen mejoradas mientras que se mantiene en el estándar de seguridad de exposición de luz para evitar efectos fototóxicos. Las longitudes de onda optimizadas incluyen longitudes de onda infrarroja e infrarroja cercana. Estas etiquetas son bien conocidos en la técnica e incluyen colorantes tales como IRDye 700, IRDye 800, Dy-776 y D-781. También se incluyen las sustancias fluorescentes formadas mediante la conjugación de tales colorantes con otras moléculas tales como proteínas y ácidos nucléicos. Es preferible que las longitudes de onda optimizadas causen poca o ninguna inflamación al ser administradas. La etiqueta de longitud de onda optimizada de esta invención es Dy-776, ya que se ha descubierto que causa poca o ninguna inflamación en el ojo, mientras que otros colorantes pueden causar inflamación. Los colorantes optimizados también demuestran preferiblemente una estrecha correlación entre el nivel de fluorescencia

que puede ser detectado histológicamente y el que puede ser detectado in vivo. Es preferible fundamentalmente que exista una correlación sustancial, especialmente una correlación 1:1 entre la fluorescencia histológica e in vivo.

El marcador de muerte celular etiquetado puede prepararse utilizando técnicas estándar para conjugar una etiqueta de longitud de onda optimizada con un compuesto marcador. Tales etiquetas pueden ser obtenidos de fuentes bien conocidas tales como Dyomics. Las técnicas apropiadas para conjugar la etiqueta con el marcador son conocidas en la técnica y puede ser proporcionadas por el fabricante de la etiqueta.

Con el fin de generar una imagen de la muerte celular, el marcador etiquetado se administra al sujeto, mediante, por ejemplo, inyección intravenosa. El área del objeto a visualizar, el ojo, se coloca dentro del campo de detección de un escáner médico. Después se escanean las longitudes de onda de emisión del marcador etiquetado y se construye una imagen de manera que cree un mapa de las zonas de muerte celular. La generación de la imagen se puede repetir permitiendo la monitorización de la muerte celular durante un periodo de tiempo. Se puede monitorizar en tiempo real. En especial se prefiere monitorizar la muerte celular de las células de la retina, especialmente de las células nerviosas de la retina. Las células nerviosas de la retina incluyen las células ganglionares, bipolares, amacrinas, horizontales y las células fotorreceptoras de la retina.

El marcador de muerte celular etiquetado se puede administrar localmente o sistémicamente. Los métodos para administrar el marcador son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la inyección intravenosa. Aunque los marcadores de muerte celular etiquetados se hayan administrado por vía intravenosa, los inventores han descubierto que sorprendentemente cruzan la barrera sanguínea de la retina permitiendo la visualización en el ojo. Los trabajos anteriores demostraron que el colorante Alexa Fluor 488 nm no se podía visualizar in vivo después de administración intravenosa, a pesar de que se demostró histológicamente su capacidad para cruzar la barrera sanguínea de la retina. Como alternativa, aunque menos preferente, el marcador de muerte celular etiquetado puede administrarse por vía tópica u ocular.

También se proporciona una composición farmacéutica, especialmente una composición de diagnóstico, que comprende un marcador de muerte celular etiquetado, en particular una anexina, con el marcador de... [Seguir leyendo]

1. Un marcador de muerte celular etiquetado con una etiqueta que tiene una longitud de onda dentro del espectro infrarrojo, para uso en la identificación de muerte celular en el ojo, donde el marcador de muerte celular es una anexina y la etiqueta es DY-776 que tiene la siguiente estructura:

2. El marcador de muerte celular según la reivindicación 1, donde el marcador de muerte celular es anexina 5, 11, 2 ó 6.

3. Un marcador de muerte celular según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el marcador está

destinado a la identificación de la muerte celular de las células de la retina, tal como la muerte de las células del 10 nervio retiniano.

4. Un marcador de muerte celular según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el marcador está destinado a la identificación de la muerte celular de células individuales.

5. Un marcador de muerte celular según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el marcador está destinado al diagnostico del glaucoma, de la retinopatía diabética o de la enfermedad de Alzheimer.

6. Una composición farmacéutica que comprende una anexina etiquetada con DY-776, donde DY-776 tiene la estructura siguiente

y donde la composición es adecuada para administración intravenosa, ocular o tópica