Liposomas recubiertos con el dominio extracelular de la proteína APO2L/TRAIL.

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología y la medicina. Específicamente, la presente invención se refiere a un compuesto que comprende un liposoma recubierto o decorado, al menos, con el dominio extracelular de la proteína APO2L/TRAIL y a su uso para la elaboración de un medicamento, preferiblemente, para el tratamiento de un cáncer o de enfermedades inflamatorias o autoinmunes, como la artritis reumatoide.

Liposomas recubiertos con el dominio extracelular de la proteína APO2L/TRAIL.

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología y la medicina. Específicamente, la presente invención se refiere a un compuesto que comprende un liposoma recubierto o decorado, al menos, con el dominio extracelular de la proteína APO2L/TRAILyasuuso para la elaboración de un medicamento, preferiblemente, para el tratamiento de un cáncer o de enfermedades inflamatorias o autoinmunes, como la artritis reumatoide.

Estado de la técnica anterior APO2L/TRAIL es una proteína de la familia del TNF (Tumor Necrosis Factor) que actúa como ligando mortal induciendo la muerte celular al activar la vía extrínseca de la apoptosis (Pitti et al. 1996. J Biol Chem 271: 1268790; Wiley et al. 1995. Immunity 3: 673-82) . APO2L/TRAIL es capaz de inducir la apoptosis de las células tumorales sin afectar a las células normales. Esta observación ha propiciado que la vía de señalización de esta molécula tenga un gran potencial terapéutico en el tratamiento del cáncer (Mitsiades et al. 2001. Blood 98: 795-804; Marini et al. 2006. Oncogene 25: 5145-54; Mitsiades et al. 2001. Expert Opin Investig Drugs 10: 1521-30; Duiker et al. 2006. Eur J Cancer 42: 2233-40; Daniel et al. 2007. Blood 110: 4037-46; Xu et al. 2003. World J Gastroenterol 9: 1241-5) . El uso de diversas formas recombinantes de APO2L/TRAIL en ensayos preclínicos para inducir la apoptosis de células tumorales, bien en monoterapia, bien en combinación con otras terapias, ha sido descrito en las solicitudes de patente con número de publicación EP1957529, US6444640, CA2544923, WO9701633, WO02069995 o WO03028001. De hecho, su uso para el tratamiento de diversas neoplasias malignas se está evaluando actualmente en diversos ensayos clínicos (Johnstone et al. Nat Rev Cancer. 2008 Oct; 8:782-98) .

APO2L/TRAIL también ha sido implicado en el proceso denominado muerte celular inducida por activación (AICD, del inglés, Activation Induced Cell Death) mediante el cual los linfocitos T activados que se generan durante una respuesta inmune son eliminados para recuperar la homeostasis (Anel et al. 2007. Front Biosci 12: 207484; Bosque et al. 2008. J Leukoc Biol 84:488-98; Bosque et al. 2005. J Leukoc Biol 77: 568-78; Bosque A et al. 2005 Eur J Immunol 35: 1812-21; Martinez-Lorenzo et al. 1998. Eur J Immunol 28: 2714-25) . La implicación de APO2L/TRAIL en fenómenos de regulación del sistema inmune y en la patogénesis de las enfermedades autoinmunes ha sido corroborada en los estudios realizados en el ratón KO para APO2L/TRAIL (Lamhamedi-Cherradi et al. 2003. Nat Immunol 4: 255-60) . La Artritis Reumatoide (AR) es una enfermedad de base autoinmune en la que el sistema inmune ataca y destruye fundamentalmente las articulaciones. Se cree que una apoptosis defectiva podría contribuir a la perpetuación de los linfocitos T activados presentes en el líquido sinovial, responsables de la destrucción articular característica de la AR. Por ejemplo, aunque los linfocitos T activados presentes en el líquido sinovial de pacientes con AR son sensibles a la muerte celular inducida por APO2L/TRAIL, parece existir en el líquido sinovial de estos pacientes un defecto en la secreción de APO2L/TRAIL asociado a exosomas (Martinez-Lorenzo et al. 2007. Clin Immunol 122: 28-40) . El uso de APO2L/TRAIL recombinante también puede ser una terapia efectiva para el tratamiento de la AR (Yao et al. 2006. Arthritis Res Ther 8: R16; solicitud de patente con número de publicación WO0122987) .

Por otra parte, los liposomas son vesículas lipídicas utilizadas como sistemas de almacén o de transporte de fármacos para el tratamiento de diversas enfermedades como, por ejemplo, el cáncer o la AR. La unión de ligandos a la superficie de los liposomas que favorezcan la vectorización de los liposomas hacia células diana también es conocida (Samad et al. 2007. Curr Drug Deliv 4: 297-305; Schwendener. 2007. Adv Exp Med Biol 620: 117-28; Metselaar et al. 2004. Ann Rheum Dis 63: 348-53; Ceponis et al. 2001. Arthritis Rheum 44: 1908-16; Trif et al. 2007. J Liposome Res 17: 237-48) .

Por tanto, el uso de APO2L/TRAIL recombinante es una aproximación terapéutica útil en el tratamiento del cáncer, así como de enfermedades inflamatorias o autoinmunes como, por ejemplo, la AR. No obstante, el desarrollo de compuestos que potencien su actividad terapéutica y/o disminuir la dosis terapéutica necesaria permitiría mejorar significativamente la eficacia del tratamiento y/o la calidad de vida de los pacientes.

Explicación de la invención La presente invención se refiere a un compuesto que comprende un liposoma recubierto o decorado, al menos, con el dominio extracelular de la proteína APO2L/TRAILyasuuso para la elaboración de un medicamento, preferiblemente, para el tratamiento de un cáncer o de enfermedades inflamatorias o autoinmunes, como la artritis reumatoide.

Los autores de la presente invención han generado liposomas artificiales de características similares a las de los exosomas naturales secretados por las células en lo que se refiere a su composición lipídica y tamaño, a los cuales se les ha incorporado la proteína APO2L/TRAIL bioactiva en su superficie (LUV-APO2L/TRAIL) .

En estudios de citotoxicidad realizados in vitro sobre distintas líneas celulares tumorales se ha podido comprobar que la capacidad de inducir muerte celular es mayor con LUV-APO2L/TRAIL que con APO2L/TRAIL soluble. Concretamente, la concentración inhibitoria media es unas 5 veces menor en el caso de los liposomas decorados con APO2L/TRAIL respecto a la proteína soluble como media de las líneas celulares tumorales analizadas.

Por otra parte, utilizando un modelo animal de artritis inducida por antígeno (AIA) se ha demostrado que la inyección intra-articular de LUV-APO2L/TRAIL es capaz de reducir la inflamación de las articulaciones afectadas de artritis de manera más eficaz que cuando se inyecta la proteína APO2L/TRAIL soluble.

APO2L/TRAIL es una proteína transmembrana de tipo II perteneciente a la superfamilia del TNF. La proteína APO2L/TRAIL de Homo sapiens tiene 281 aminoácidos y su número de acceso del Genebank es NP003801.1 (SEQ ID: 3) . Consta de un dominio intracelular (aminoácidos 1-17) , un dominio transmembrana (aminoácidos 18-38) y un dominio extracelular (aminoácidos 39-281; SEQ ID: 2) . Este dominio extracelular puede ser liberado al medio, pudiendo así aparecer de forma soluble. Se han generado varias proteínas recombinantes de APO2/TRAIL soluble con diferentes tamaños, que contienen, por ejemplo, los aminoácidos 91-281, 95-281 ó 114-281 (SEQ ID: 1) . Estas proteínas recombinantes se han empleado para estudiar la relación entre la estructura y la función de APO2L/TRAIL. Además, estas proteínas recombinantes de APO2/TRAIL solubles están siendo comercializadas por diferentes casas comerciales como, por ejemplo, Calbiochem® con número de catálogo 616376, Bender MedSystems® con número de catálogo BMS356, Prepotech® con número de catálogo 310-4, Biovisión, Inc. con número de catálogo 4354-50, Cell Sciences® con número de catálogo CRT500 o Chemicon® GF092.

Un primer aspecto de la presente invención, que de ahora en adelante denominaremos "composición de la invención", se refiere a un compuesto que comprende un liposoma recubierto o "decorado", al menos, con la proteína de secuencia aminoacídica SEQ ID: 2 o cualquiera de sus variantes o porciones de las mismas biológicamente activas.

En el sentido utilizado en esta descripción, el término "variante" se refiere a una proteína sustancialmente homologa y funcionalmente equivalente a la proteína de secuencia aminoacídica SEQ ID: 2. En general, una variante incluye adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos que no alteren sustancialmente su función. El término "variante" incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones postranslacionales como, por ejemplo, pero sin limitarse, glicosilación o fosforilación.

Tal como aquí se utiliza, una proteína es "sustancialmente homologa" a la proteína de secuencia aminoacídica SEQ ID: 2, cuando su secuencia de aminoácidos presenta un buen alineamiento con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID: 2, es decir, cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID:2, de, al menos, un 60%, típicamente de, al menos, un 80%, ventajosamente de, al menos, un 85%, preferentemente de, al menos un 90%, más preferentemente de, al menos, un 95%, y, aún más preferentemente de, al menos, un 99%. Las secuencias... [Seguir leyendo]

1. Liposoma recubierto, al menos, con una porción biológicamente activa del dominio extracelular de la proteína APO2L/TRAIL cuya secuencia es SEQ ID NO: 2, donde dicha porción presenta una secuencia con una identidad de al menos un 80% con la SEQ ID NO: 1.

2. Liposoma según la reivindicación 1, donde la porción biológicamente activa presenta una identidad de al menos un 90% con la SEQ ID NO: 1.

3. Liposoma según la reivindicación 2, donde la porción biológicamente activa presenta una identidad de al menos un 95% con la SEQ ID NO: 1.

4. Liposoma según la reivindicación 3, donde la porción biológicamente activa es la SEQ ID NO: 1.

5. Liposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la porción biológicamente activa tiene unida en su extremo amino-terminal, al menos, 6 histidinas.

6. Liposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la porción biológicamente activa tiene unida en su extremo amino-terminal, al menos, 10 histidinas.

7. Liposoma recubierto, al menos, con el dominio extracelular de la proteína APO2L/TRAIL que tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID: 2 o con cualquiera de sus variantes o porciones de las mismas biológicamente activas que comprende una porción biológicamente activa según se describe en cualquiera de las reivindicaciones1a6.

8. Liposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el liposoma es unilamelar grande (LUV) con un diámetro de entre 40 nm y 500 nm.

9. Liposoma según la reivindicación 8 donde el LUV tiene un diámetro de entre 100 nm y 200 nm.

10. Liposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde el liposoma comprende al menos un fosfolípido seleccionado de entre: fosfatidilcolina y/o esfingomielina.

11. Liposoma según la reivindicación 10 donde el liposoma comprende además un esteral.

12. Liposoma según la reivindicación 11 donde el esteral es el colesterol.

13. Liposoma según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 donde el liposoma comprende además un lípido quelante.

14. Liposoma según la reivindicación 13 donde el lípido quelante es DOGS-NTA-Ni.

15. Uso del liposoma según cualquiera de las reivindicaciones1a14 para la elaboración de un medicamento.

16. Uso del liposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de un cáncer.

17. Uso del liposoma según la reivindicación 16 donde el cáncer se selecciona de entre: linfoma, leucemia, plasmocitoma, mieloma o cáncer de pulmón.

18. Uso del liposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedades inflamatorias o autoinmunes.

19. Uso del liposoma según la reivindicación 18 donde la enfermedad inflamatoria o autoinmune es la artritis reumatoide.

20. Composición farmacéutica que comprende el liposoma según cualquiera de las reivindicaciones1a14.

21. Composición farmacéutica según la reivindicación 20 que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21 que comprende además otro principio activo.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Universidad de Zaragoza Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea (UPV/EHU) Centro Superior de investigaciones Científicas (CSIC)

<120> Liposomas recubiertos con el dominio extracelular de la proteína APO2/TRAIL

<130> 1510.30

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 168

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 1

<210> 2

<211> 243

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 2

<210> 3

<211> 281

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 3

ES 2 356 880 Bl

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

Nº solicitud: 200930618

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 21.08.2009

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional DOCUMENTOS RELEVANTES

2. 40, todo el documento. 1-22 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº : Fecha de realización del informe 31.03.2011 Examinador M. Novoa Sanjurjo Página 1/5

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 200930618

CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD

A61K9/133 (2006.01) A61K47/48 (2006.01) A61P35/00 (2006.01) A61P37/00 (2006.01)

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

A61K, A61P

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)

INVENES, EPODOC, HCAPLUS, BIOSIS, EMBASE, MEDLINE

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OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200930618

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 31.03.2011

Declaración

2. 22 SI NO Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Reivindicaciones Reivindicaciones 1-22 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Consideraciones:

La invención consiste en un liposoma decorado con el dominio extracelular (114-281) de la proteína APO2L/TRAIL. El liposoma de la invención es unilamelar grande (LUV) y comprende en su estructura fosfatidilcolina, esfingomielina y colesterol. Los lípidos se unen a la proteína que tiene en su extremo N terminal 10xHis, formando un compuesto de coordinación con el lípido quelante DOGS-NTA-Ni.

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OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200930618

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

2. 40, todo el documento.

El documento D01, describe los cambios que se producen en la estructura de la proteína APO2L/TRAIL en medio ácido. Los ensayos se realizan con liposomas unilamelares de 100 nm de diámetro unidos al fragment.

11. 281 de la proteína APO2L/TRAIL. El documento D02, describe un ensayo de terapia génica contra un teratocarcinoma de ratón en el que la transfección de un plásmido que codifica la secuenci.

11. 281 de la proteína APO2L/TRAIL, se realiza por inyección intratumoral de un complejo ADN:liposoma. El liposoma del ensayo es el liposoma catiónico (DOTAP) :colesterol El documento D03, describe el potencial terapéutico de proteínas recombinantes y péptidos sintéticos que unidas a residuos de poli histidina, pueden unirse específicamente a liposomas que contienen un lípido quelante como DOGS-NTA-Ni. Esta estructura permite la internalización de los péptidos. El documento D04, es una revisión sobre la proteína Apo2L/TRAIL y su implicación en la regulación inmune. En el apartado 2.2.2. se analiza la aplicación como agente antitumoral y en el apartado 7., la aplicación en el tratamiento de enfermedades autoinmunes con especial mención a la artritis reumatoide. El documento D05, describe actividad de APO2L/TRAIL frente a la acumulación de células T que se produce en el líquido sinovial de enfermos de artritis reumatoide, lo que la convierte en un candidato para tratar la enfermedad.

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración NOVEDAD Reivindicaciones 1-4, 7-10, 15-17.

2. 22 La reivindicación 1, está redactada de una forma tan general que cualquier liposoma que comprenda en su estructura la SEQ ID nº 2 que se corresponde con el dominio extracelular de la proteína Apo2L/TRAIL, o parte de ella como el fragment.

11. 281 de las reivindicaciones 2-5 y descrito en el documento D01, ataca su novedad. En dicho documento también se menciona que TRAIL es conocida por su actividad apoptótica en varias líneas celulares de tejidos cancerosos. Las reivindicaciones 7-10, 15-17 .

2. 22 en la medida en que dependen de las reivindicaciones 1-4, carecen de novedad y no cumplen los requisitos del Art. 6 de la LP. Reivindicaciones 5, 6, 11-14, 18, 19 Las reivindicaciones 5, 6, 11-14, 18 y 19 son nuevas. No se ha encontrado en el estado de la técnica un liposoma APO2L/TRAIL-10xHis-DOGS-NTA-Ni-Colesterol/Esfingomielina/Fosfatidilcolina. Tampoco se ha descrito el liposoma del documento D01 para tratar la artritis reumatoide. Las reivindicaciones 5, 6, 11-14, 18 y 19, cumplen los requisitos del Art. 6 de la LP. ACTIVIDAD INVENTIVA Reivindicaciones 1-22 El documento D03, describe un método para internalizar un péptido por medio de un liposoma que se construye con una disposición similar a la del liposoma de la invención, uniendo una cadena de 10 His al N terminal del péptido/proteína y el lípido DOGS-NTA-Ni a los lípidos que forman la vesícula unilamelar. La diferencia es que en el caso del documento D03 el péptido es AntpHD-Cw3 y en el liposoma de la solicitud la proteína es el fragment.

11. 281 del dominio extracelular de la proteína APO2L/TRAIL. Este fragmento ha sido descrito previamente en los documentos D01 y D02 como un péptido con actividad antitumoral.

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OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200930618

El documento D04, recoge información sobre la actividad de APO2L/TRAIL como agente antitumoral y D05 describe actividad del fragment.

11. 281 de APO2L/TRAIL frente a la acumulación de células T que se produce en el líquido sinovial de enfermos de artritis reumatoide. De la información contenida en los documentos D01-D05, se deduce que el liposoma de la invención no supone un esfuerzo inventivo respecto al liposoma descrito en el documento D03 combinado con el péptido de actividad farmacológica descrito en los documentos D01, D02, D04 y D05. Resultaría obvio para el experto en la materia, la obtención del liposoma de la solicitud utilizando los materiales y reactivos descritos en dichos documentos; por tanto, las reivindicaciones 1-22 carecen de actividad inventiva y no cumplen los requisitos del Art. 8 de la LP.

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