LIGANDO NATURAL DEL RECEPTOR ACOPLADO A PROTEÍNAS G RCC356 Y USOS DEL MISMO.

Método in vitro de identificación de un agente que se une a RCC356 o para detectar la presencia de tal agente en dicha muestra,

comprendiendo dicho método: a) poner en contacto un polipéptido de RCC356 con ácido isovalérico en presencia o en ausencia de un modulador candidato o de dicha muestra en condiciones que permiten la unión de dicho ácido isovalérico a dicho polipéptido de RCC356; y b) medir la unión de dicho polipéptido de RCC356 a dicho ácido isovalérico, en el que una disminución en la unión en presencia de dicho modulador candidato o dicha muestra, en relación con la unión en ausencia de dicho modulador candidato o dicha muestra, identifica dicho modulador candidato como un agente que se une a RCC356 o indica la presencia de tal agente en dicha muestra, y en el que dicho polipéptido de RCC356 tiene una identidad de aminoácidos del 80% o más con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5 y puede unirse a ácido isovalérico

Ligando natural del receptor acoplado a proteínas G RCC356 y usos del mismo.

Campo de la invención La invención se refiere a la identificación del ligando natural para el receptor acoplado a proteínas G (GPCR) RCC356 y a usos del mismo.

Antecedentes de la invención Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) son proteínas responsables de la transducción de una señal dentro de una célula. Los GPCR tienen habitualmente siete dominios transmembrana. Tras la unión de un ligando a un fragmento o parte extracelular de un GPCR, se transduce una señal dentro de la célula que da como resultado un cambio en un comportamiento o propiedad fisiológica o biológica de la célula. Los GPCR, junto con las proteínas G y los efectores (enzimas intracelulares y canales modulados por proteínas G) , son los componentes de un sistema de señalización modular que conecta el estado de segundos mensajeros intracelulares con entradas extracelulares.

Los genes de GPCR y los productos génicos pueden modular diversos procesos fisiológicos y son posibles agentes causantes de enfermedad. Los GPCR parecen ser de importancia crítica tanto para el sistema nervioso central como para procesos fisiológicos periféricos.

La superfamilia de proteínas de GPCR está representada por cinco familias: Familia I, receptores tipificados por rodopsina y el receptor beta2-adrenérgico actualmente representados por más de 200 miembros únicos; Familia II, la familia de receptores de secretina/calcitotina/hormonas paratiroideas; Familia III, la familia de receptores metabotrópicos de glutamato, Familia IV, la familia de receptores de AMPc, importantes en la quimiotaxia y el desarrollo de D. discoideum; y Familia V, el receptor de feromonas de apareamiento fúngico tal como STE2.

Las proteínas G representan una familia de proteínas heterotriméricas compuestas por subunidades !, ∀ y #, que se unen a nucleótidos de guanina. Estas proteínas se unen habitualmente a receptores de superficie celular (receptores que contienen siete dominios transmembrana) para la transducción de señales. De hecho, tras la unión del ligando a GPCR, se transmite un cambio conformacional a la proteína G, que provoca que la subunidad ! intercambie una molécula de GDP unida por una molécula de GTP y se disocie de las subunidades ∀#.

La forma unida a GTP de las subunidades !, ∀ y # funciona normalmente como un resto modulador de efector, que conduce a la producción de segundos mensajeros, tales como AMPc (por ejemplo mediante la activación de adenil ciclasa) , diacilglicerol o inositol fosfatos.

Se conocen más de 20 tipos diferentes de subunidades ! en seres humanos. Estas subunidades se asocian con un pequeño conjunto de subunidades ∀ y #. Los ejemplos de proteínas G de mamífero incluyen Gi, Go, Gq, Gs, G-olf y Gt. Las proteínas G se describen extensamente en Lodish et al., Molecular Cell Biology (Scientific American Books Inc., Nueva York, N.Y., 1995; y también por Downes y Gautam, 1999, The G-Protein Subunit Gene Families. Genomics 62:544-552) .

Los GPCR conocidos y no caracterizados constituyen actualmente dianas importantes para el desarrollo y la acción de fármacos. Para algunos GPCR, se ha asignado un posible papel fisiológico, sin embargo, no se ha identificado aún ningún ligando que pueda modular dicho receptor. Hay esfuerzos en marcha para identificar nuevos receptores acoplados a proteínas G que puedan usarse para seleccionar nuevos agonistas y antagonistas que tengan potencial profiláctico y propiedades terapéuticas.

Se han clonado hasta la fecha más de 300 GPCR. Mecanísticamente, aproximadamente el 50-60% de todos los fármacos clínicamente relevantes actúan modulando las funciones de diversos GPCR (Cudermann et al., J. Mol. Med., 73:51-63, 1995) .

El sentido del olfato permite comunicaciones químicas entre organismos vivos desde invertebrados hasta mamíferos y el entorno. La percepción y discriminación de miles de odorizantes se realiza a través del olfato. Tal señalización química puede modular el comportamiento social de la mayoría de las especies animales que se basan en compuestos odorizantes para identificar a familiares o a la pareja, localizar alimento o reconocer el territorio por ejemplo. La capacidad de oler está determinada inicialmente por neuronas del epitelio olfativo, las neuronas sensoriales olfativas (OSN) . En ellas, las moléculas odorizantes se unen a proteínas receptoras olfativas (RO) , también conocidas como receptores de odorizantes. Estos RO son miembros de la superfamilia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) . Están codificados por la familia génica más grande. Mientras que en roedores se han identificado tantos como 1.300 genes de RO diferentes, se han identificado alrededor de 800 genes de RO en el genoma humano. Se cree que cada neurona olfativa expresa sólo un tipo de RO, formando por tanto la base celular de la discriminación de odorizantes por neuronas olfativas. Se sintetizan en el retículo endoplasmático, se transportan y finalmente se concentran en la membrana de la superficie celular de los cilios en la punta de la dendrita. De manera similar, se encuentran RO en el terminal axónico de OSN. Se supone que desempeñan un papel en el direccionamiento de axones a zonas del bulbo olfativo específicas de RO.

La mayoría de los mamíferos tienen un sistema olfativo secundario, el sistema vomeronasal. El órgano vomeronasal se localiza en la cavidad nasal y está compuesto parcialmente por neuronas sensoriales vomeronasales. Este sistema sería responsable de la detección de feromonas a través de la activación de receptores de feromonas. Sin embargo, no hay pruebas para afirmar que la detección de feromonas se realiza únicamente a través de neuronas sensoriales vomeronasales y que las neuronas sensoriales vomeronasales detectan feromonas sólo. Los receptores de feromonas son también proteínas 7TM, pero son completamente distintas de las superfamilia de RO. Aún cuando los receptores de feromonas son parte de la superfamilia de GPCR, no se ha identificado aún ninguna proteína G acoplada a estos receptores. Se han enumerado hasta la fecha dos familias de receptores de feromonas: las familias V1 R y V2R. Se han identificado receptores de ambas de las mismas en ratón (más de 300) mientras que sólo 5 receptores de la familia V1 R en seres humanos.

El gusto es también parte de la quimiosensibilidad. Se basa en la activación de receptores del gusto ubicados en la lengua y el paladar en seres humanos. Se expresan en células receptoras del gusto (TCR) , parte de las papilas gustativas. Estas células son células epiteliales especializadas que entran en contacto con neuronas, que a su vez transmiten la información al cerebro. De ese modo, a diferencia de las OSN, las TCR no son células neuronales. Como los receptores olfativos, los receptores del gusto son parte de la superfamilia de GPCR. En la actualidad, se han identificado 2 familias: las familias T1 R y T2R. Mientras que la familia T1 R está constituida por tres receptores, concretamente T1R1, T1 R2 y T1R3, la familia T2R está constituida por 25 supuestos receptores en seres humanos. Los receptores T2R son responsables de la detección del sabor amargo y serían funcionales como monómeros. Sin embargo, se cree que los receptores T1R funcionan como dímeros. La dimerización conferiría especificidad a los receptores. Heterodimeros de T1R1/T1R3 detectan el sabor umami, mientras que heterodímeros de T1R2/T1R3 se activan por compuestos dulces. Además de estas dos familias, se cree que otras proteínas son receptores del gusto tales como TRMP5, un posible canal, mGluR4 que podría funcionar como receptor de umami, ASIC2, un receptor del sabor ácido, ENaC, un receptor del sabor salado, VN1, un receptor del sabor picante o TMP8, un receptor del sabor frío.

El olor, el gusto y las feromonas influyen de manera constante en el comportamiento personal de animales y seres humanos. Por tanto, es de gran importancia comprender los mecanismos de tales percepciones. Lo más particularmente, para determinar medios para influir en los mismos. Se sabe ya que los sistemas olfativo, del gusto y de las feromonas no siguen la norma de un ligando/un receptor. Se ha descrito en la bibliografía que varios ligandos activan los mismos receptores. Por tanto, dichos sistemas sensoriales son probablemente parte de un sistema en el que pueden activarse diferentes receptores por los mismos ligandos, y en el que un receptor puede modularse por diferentes ligandos.

RCC356, también denominado PHOR-1, se ha... [Seguir leyendo]

1. Método in vitro de identificación de un agente que se une a RCC356 o para detectar la presencia de tal agente en dicha muestra, comprendiendo dicho método:

a) poner en contacto un polipéptido de RCC356 con ácido isovalérico en presencia o en ausencia de un 5 modulador candidato o de dicha muestra en condiciones que permiten la unión de dicho ácido isovalérico a dicho polipéptido de RCC356; y b) medir la unión de dicho polipéptido de RCC356 a dicho ácido isovalérico, en el que una disminución en la unión en presencia de dicho modulador candidato o dicha muestra, en relación con la unión en ausencia de dicho modulador candidato o dicha muestra, identifica dicho modulador candidato como un agente que se une a RCC356 o indica la presencia de tal agente en dicha muestra, y en el que dicho polipéptido de RCC356 tiene una identidad de aminoácidos del 80% o más con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5 y puede unirse a ácido isovalérico.

2. Método in vitro de identificación de un agente que modula la función de RCC356 o para detectar la presencia de tal agente en una muestra, comprendiendo dicho método:

a) poner en contacto un polipéptido de RCC356 con ácido isovalérico en presencia o en ausencia de un modulador candidato o de dicha muestra, en condiciones que permiten la activación de dicho polipéptido de RCC356 por ácido isovalérico, y b) medir una actividad de señalización de dicho polipéptido de RCC356, en el que un cambio en la actividad en presencia de dicho modulador candidato o dicha muestra en relación con la actividad en ausencia de dicho modulador candidato o dicha muestra identifica dicho modulador candidato como un agente que modula la función de RCC356 o indica la presencia de tal agente en dicha muestra, y en el que dicho polipéptido de RCC356 tiene una identidad de aminoácidos del 80% o más con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5 y puede unirse a ácido isovalérico.

3. Método in vitro de identificación de un agente que modula la función de RCC356 o para detectar la 25 presencia de tal agente en una muestra, comprendiendo dicho método:

a) poner en contacto un polipéptido de RCC356 con un modulador candidato o con dicha muestra;

b) medir una actividad de señalización de dicho polipéptido de RCC356 en presencia de dicho modulador candidato o dicha muestra; y c) comparar dicha actividad medida en presencia de dicho modulador candidato o dicha muestra con la actividad medida en una reacción en la que dicho polipéptido de RCC356 se pone en contacto con ácido isovalérico a su CE50, en el que dicho modulador candidato se identifica como un agente que modula la función de RCC356 cuando la cantidad de dicha actividad medida en presencia de dicho modulador candidato es al menos el 10% de la cantidad inducida por dicho ácido isovalérico presente a su CE50, o en el que dicho agente se detecta en dicha muestra si la cantidad de dicha actividad medida en presencia de dicha muestra es al menos el 10% de la cantidad inducida por dicho ácido isovalérico presente a su CE50, y en el que dicho polipéptido de RCC356 tiene una identidad de aminoácidos del 80% o más con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5 y puede unirse a ácido isovalérico.

4. Método según la reivindicación 1, en el que dicho ácido isovalérico está marcado de manera detectable.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dicho ácido está marcado de manera detectable con un resto

seleccionado del grupo que consiste en un radioisótopo, un fluoróforo, un extintor de fluorescencia y un resto detectable por RMN.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha puesta en contacto se realiza en o sobre una célula que expresa dicho polipéptido de RCC356.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha puesta en contacto se realiza en o 45 sobre liposomas sintéticos.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha puesta en contacto se realiza en o sobre membranas en gemación inducidas por virus que contienen dicho polipéptido de RCC356.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, realizándose dicho método usando una fracción de membrana de células que expresan dicho polipéptido de RCC356.

50 10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, realizándose dicho método sobre un chip de proteínas.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha medición se realiza usando un método seleccionado de desplazamiento de marcador, resonancia de plasmón superficial, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, extinción de fluorescencia y polarización de fluorescencia.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho agente se selecciona del grupo que consiste en un péptido, un polipéptido, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, un lípido, un hidrato de carbono, un ácido nucleico y una molécula orgánica pequeña incluyendo pero sin limitarse a un compuesto odorizante y una feromona.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 y 6 a 12, en el que dicha etapa de medición de una actividad de señalización de dicho polipéptido de RCC356 comprende detectar un cambio en el nivel de un segundo mensajero.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 y 6 a 13, en el que la etapa de medición de una actividad de señalización comprende la medición de la unión/acoplamiento o intercambio de un nucleótido de guanina, actividad adenilato ciclasa, AMPc, actividad proteína cinasa C, actividad proteína cinasa A, descomposición de fosfatidilinositol, diacilglicerol, inositol trifosfato, calcio intracelular, flujo de calcio, ácido araquidónico, actividad MAP cinasa, actividad tirosina cinasa, cambio de la coloración celular debido a melanosomas, internalización de receptores o expresión de gen indicador.

15. Método según la reivindicación 14, en el que dicha actividad de señalización se mide usando un ensayo de fluorescencia o luminiscencia, un ensayo de melanóforos o un ensayo de internalización de receptores.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, siendo dicho método un método de selección de alto rendimiento.

17. Método según cualquier reivindicación 1 a 16, en el que dicho agente es parte de una biblioteca química o extractos orgánicos animales.

18. Método in vitro de modulación de la actividad de un polipéptido de RCC356 en una célula, comprendiendo

dicho método la etapa de suministrar a dicha célula ácido isovalérico que modula la actividad de un polipéptido de RCC356, de manera que se modula la actividad de RCC356, y en el que dicho polipéptido de RCC356 tiene una identidad de aminoácidos del 80% o más con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5 y puede unirse a ácido isovalérico.

19. Composición que comprende un polipéptido de RCC356 aislado y ácido isovalérico, y en la que dicho polipéptido de RCC356 tiene una identidad de aminoácidos del 80% o más con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5 y puede unirse a ácido isovalérico.

20. Uso de ácido isovalérico y un polipéptido de RCC356 aislado para la producción de una composición que comprende dicho polipéptido de RCC356 aislado y dicho ácido isovalérico, y en el que dicho polipéptido de RCC356 tiene una identidad de aminoácidos del 80% o más con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5 y puede unirse a ácido isovalérico.

21. Uso de ácido isovalérico y un polipéptido de RCC356 aislado para la producción de un kit para seleccionar agentes que modulan la señalización de RCC356, para la producción de un kit para el diagnóstico o pronóstico de cáncer o metástasis tumoral, o para la producción de un kit para seleccionar odorizantes o antagonistas de odorizantes, y en el que dicho polipéptido de RCC356 tiene una identidad de aminoácidos del 80% o más con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5 y puede unirse a ácido isovalérico.

22. Uso de ácido isovalérico como ligando para un polipéptido de RCC356 aislado, y en el que dicho polipéptido de RCC356 tiene una identidad de aminoácidos del 80% o más con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5 y puede unirse a ácido isovalérico.

23. Método in vitro de diagnóstico o pronóstico de disfunción olfativa relacionada con ácido isovalérico, 45 comprendiendo dicho método:

a) cuantificar el contenido en RCC356 de una muestra de tejido, en el que dicho polipéptido de RCC356 tiene una identidad de aminoácidos del 80% o más con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5 y puede unirse a ácido isovalérico, o cuantificar el ARNm que codifica para dicho RCC356 y/o verificar la exactitud de la secuencia de RCC356 en comparación con la secuencia de RCC356 de tipo natural en una muestra 50 de tejido; y b) comparar la cantidad de dicho receptor cuantificada en la etapa (a) con un patrón, o comparar la cantidad y/o la exactitud de dicho ácido nucleico cuantificada o determinada en la etapa (a) con un patrón, en el que una diferencia en dicha cantidad de RCC356 o una diferencia en la secuencia de RCC356 en relación con dicho patrón es un diagnóstico o pronóstico de disfunción olfativa.

24. Método según la reivindicación 23, en el que la cuantificación se realiza usando anticuerpos frente a RCC356, o ácido isovalérico.

25. Kit que comprende un polipéptido de RCC356 aislado, ácido isovalérico y materiales de envasado para los

mismos, y en el que dicho polipéptido de RCC356 tiene una identidad de aminoácidos del 80% o más con 5 la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5 y puede unirse a ácido isovalérico.

26. Kit que comprende un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido de RCC356, ácido isovalérico y materiales de envasado para los mismos, y en el que dicho polipéptido de RCC356 tiene una identidad de aminoácidos del 80% o más con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5 y puede unirse a ácido isovalérico.

27. Kit que comprende una célula que expresa un polipéptido de RCC356 o membranas del mismo, ácido isovalérico y materiales de envasado para los mismos, y en el que dicho polipéptido de RCC356 tiene una identidad de aminoácidos del 80% o más con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5 y puede unirse a ácido isovalérico.

28. Kit según la reivindicación 27, en el que dicha célula está transformada con un polinucleótido que codifica 15 para dicho RCC356.

29. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, para seleccionar agentes que modulan actividad de señalización de RCC356.

30. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, para seleccionar odorizantes o agentes antiodorizantes.

31. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, para seleccionar compuestos anticancerígenos.

32. Uso de un kit según la reivindicación 31, en el que dicho cáncer se elige del grupo que consiste en cáncer de próstata, de cuello uterino, de útero, de recto, de estómago y de riñón.

33. Uso de un kit que comprende RCC356, para el diagnóstico o pronóstico de disfunción olfativa relacionada 25 con ácido isovalérico, y en el que dicho polipéptido de RCC356 tiene una identidad de aminoácidos del 80%

o más con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5 y puede unirse a ácido isovalérico.

34. Uso de un animal transgénico no humano para RCC356 para estudiar el efecto del ácido isovalérico sobre el tratamiento y/o la progresión del cáncer, y en el que dicho polipéptido de RCC356 tiene una identidad de aminoácidos del 80% o más con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5 y puede unirse a ácido isovalérico.

35. Uso según la reivindicación 34, en el que se estudia la progresión y/o el tratamiento de cáncer de próstata, de cuello uterino, de útero, de recto, de estómago y de riñón.

36. Uso de un animal transgénico no humano para RCC356 para estudiar la progresión y/o el tratamiento de disfunción olfativa relacionada con ácido isovalérico, y en el que dicho polipéptido de RCC356 tiene una

identidad de aminoácidos del 80% o más con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5 y puede unirse a ácido isovalérico.

37. Uso de un animal deficiente en RCC356 no humano para estudiar el efecto de RCC356 sobre la progresión de disfunción olfativa relacionada con ácido isovalérico, y en el que dicho polipéptido de RCC356 tiene una identidad de aminoácidos del 80% o más con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 5 y puede unirse a ácido isovalérico.

38. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, 23 ó 24, uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 y 29 a 37, composición según la reivindicación 19 o kit según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, en los que se usa un equivalente de ácido isovalérico, eligiéndose dicho equivalente del grupo que consiste en ácido propiónico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico, 45 ácido hexanoico, ácidos isohexanoicos, ácido heptanoico, ácidos isoheptanoicos, ácido octanoico, ácidos isooctanoicos, ácido nonanoico, ácidos isononanoicos, ácido valproico, ácido hexahidrobenzoico y ácido 5hexenoico.

39. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, 23 ó 24, uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 y 29 a 37, composición según la reivindicación 19 o kit según cualquiera de las 50 reivindicaciones 25 a 28, en los que se usa un equivalente de ácido isovalérico, eligiéndose dicho equivalente del grupo que consiste en ácido butírico, ácido valérico, ácido caproico, ácido oenantílico, ácido caprílico, ácido hexahidrobenzoico, ácido pelargónico y ácido 5-hexenoico.

40. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, 23 ó 24, uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 y 29 a 37, composición según la reivindicación 19 o kit según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, o método, uso, composición o kit según cualquiera de las reivindicaciones 38 a 39, en los que el polipéptido de RCC356 es una quimera o un fragmento activo del mismo que puede unirse a ácido isovalérico.