Procedimiento de ligación de aceptores de péptidos.

Un procedimiento para fijar un aceptor de péptidos a una molécula de ARN,

que comprende:

(a) proporcionar una molécula de ARN; y

(b) ligar químicamente dicho aceptor de péptidos a dicha molécula de ARN para formar un enlace covalente.

Procedimientos de ligación de aceptores de péptidos Antecedentes de la invención En general, la presente invención se refiere a procedimientos de ligación, en particular, para unir aceptores de péptidos a ácidos nucleicos.

Actualmente existen procedimientos para la preparación de fusiones de ARN-proteína. Una fusión de ARN-proteína se crea uniendo un aceptor de péptidos al extremo 3' de una molécula de ARN, seguido de la traducción in vitro o in situ del ARN. El producto es un péptido unido al extremo 3' del ARN que lo codifica. La generación de estas fusiones de ARN-proteína facilita el aislamiento de proteínas con propiedades deseadas a partir de grandes conjuntos de secuencias de aminoácidos parcial o completamente aleatorias, y resuelve el problema de recuperar y amplificar la información de la secuencia de la proteína por unión covalente de la secuencia codificante de ARN a su molécula de proteína correspondiente.

En el documento WO98/31700 se describe el uso de la ADN ligasa de T4 para unir el aceptor de péptidos puromicina a ARN por medio de un "puente" de ADN. El documento WO98/31700 también describe la preparación de moldes de traducción mínimos que contienen puromicina 3' por unión de nucleótidos individuales a puromicina inmovilizada usando una síntesis de oligonucleótidos convencional basada en fosforamidato.

Roberts y Szostak (PNAS 94:12297-12302, 1997) informan sobre la preparación de ARN sintéticos con puromicina 3' usando puromicina inmovilizada como soporte para la síntesis convencional de un engarce oligonucleotídico, y ligando la molécula de engarce de puromicina resultante a un ARN que codifica un polipéptido en tampón de ADN ligasa de T4.

En el documento WO98/155636 se describe un procedimiento para la preparación de productos de ligación quiméricos de ARN-ADN que comprenden puromicina 3' usando ARN ligasa de T4.

Tuniskaya y col. (FEBS Letters 442: 20-24, 1999) informan sobre estudios de interacción de proteína-ácido nucleico usando oligonucleótidos que contienen 2'-O-β-ribofuranosil-citidina que se oxidaron con IO4- para producir los dialdehídos correspondientes que permitían la unión covalente a la proteína investigada.

Pieles y col. (Nucleic Acids Research 17 (22) , 8967-77, 1989) describen la formación de enlaces covalentes entre un oligonucleótido que lleva psoraleno y la cadena de matriz complementaria por fotorreacción.

Misiura y col. (Nucleic Acids Res. 18 (15) : 4345-54, 1990) han descrito unidades de engarce de fosforamidita no nucleosídicas para la incorporación directa de grupos indicadores durante la síntesis de oligonucleótidos.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a procedimientos para la unión de un aceptor de péptidos a una molécula de ARN, así como a los productos de ARN-aceptor de péptidos. Estos procedimientos facilitan la producción de fusiones de ARN-proteína que pueden usarse, por ejemplo, para el aislamiento de proteínas o ácidos nucleicos con propiedades deseadas a partir de grandes conjuntos de secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos parcial o completamente aleatorias. Este procedimiento de la invención puede realizarse por una diversidad de estrategias para fijar un aceptor de péptidos a una molécula de ácido nucleico. Estos diversos enfoques difieren entre sí en los tipos de enlaces formados por la unión del péptido al ácido nucleico, y en los reactivos usados para conseguir la unión.

En el presente documento se describe un procedimiento para fijar un aceptor de péptidos a una molécula de ARN que implica proporcionar una molécula de ARN que tiene una secuencia 3' que forma una estructura de horquilla, proporcionar un aceptor de péptidos unido covalentemente a una molécula de engarce de ácido nucleico, e hibridar la molécula de ARN con la molécula de engarce de ácido nucleico en condiciones que permiten que se produzca la formación de enlaces covalentes entre el aceptor de péptidos y la molécula de ARN.

También se describe en el presente documento un procedimiento para fijar un aceptor de péptidos a una molécula de ARN que implica proporcionar un aceptor de péptidos que tiene un engarce con una secuencia 5' que forma una horquilla, hibridar el aceptor de péptidos con la molécula de ARN, y unir covalentemente el aceptor de péptidos al ARN.

En un primer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para fijar un aceptor de péptidos a una molécula de ARN ligando químicamente la molécula de ARN al aceptor de péptidos.

En una realización de este aspecto, el aceptor de péptidos está unido a un resto de psoraleno y forma enlaces cruzados con la molécula de ARN a través del resto de psoraleno. El resto de psoraleno puede estar unido al extremo 5' o 3' de una molécula de engarce que se une por sí misma al aceptor de péptidos, o el resto de psoraleno puede estar situado en una posición interna de la molécula de engarce. De acuerdo con esta técnica, el aceptor de péptidos forma enlaces cruzados con la molécula de ARN usando irradiación UV. En realizaciones adicionales de este aspecto particular, el psoraleno está unido al aceptor de péptidos a través de una cadena alquilo C6 y/o la molécula de ARN contiene un codón de terminación colocado cerca de su extremo 3'. Preferentemente, el engarce tiene una longitud comprendida entre 25 y 40 unidades nucleotídicas. Además, antes del entrecruzamiento del aceptor de péptidos a la molécula de ARN, el ARN puede hibridar con un engarce que incluye además un resto fotoescindible. El ARN hibridado después puede inmovilizarse en un soporte sólido a través del resto fotoescindible. Preferentemente, el resto fotoescindible es biotina.

En otra realización del primer aspecto de la invención, la molécula de ARN está funcionalizada y se une a un péptido que se ha modificado de manera adecuada para permitir la formación de enlaces químicos entre el aceptor de péptidos y la molécula de ARN. Preferentemente, la molécula de ARN se funcionaliza mediante oxidación con IO4-. El aceptor de péptidos puede funcionalizarse por unión al aceptor de péptidos de una molécula elegida entre el grupo que consiste en aminas, hidrazinas, (tio) hidrazidas y (tio) semicarbazonas.

En otra realización más del primer aspecto de la invención, la ligación química se realiza en ausencia de un molde externo. Como alternativa, la reacción de ligación química puede realizarse en presencia de un molde externo. Este segundo procedimiento implica alinear la molécula de ARN y la parte de engarce de un aceptor de péptidos usando un molde, de tal forma que el extremo 5' del molde hibride con la parte de engarce del aceptor de péptidos y el extremo 3' del molde hibride con la molécula de ARN. La ligación química de una molécula de ARN a un aceptor de péptidos también puede realizarse en ausencia de un molde externo por hibridación de la propia molécula de engarce, que está unida covalentemente al aceptor de péptidos, a la molécula de ARN. Esta hibridación aproxima el aceptor de péptidos y la molécula de ARN para la ligación. Preferentemente, el grupo funcional está en el extremo 5' de la región de engarce del aceptor de péptidos, o está flanqueado por un dominio de hibridación por un lado y por el aceptor de péptidos por el otro lado.

En una realización adicional del primer aspecto de la invención, la ligación química del aceptor de péptidos a la molécula de ARN implica la unión de un grupo funcional a la molécula de ARN por medio de aminación reductora del ARN, seguida de la modificación del aceptor de péptidos para reaccionar con la molécula de ARN. Las dos moléculas después se unen mediante la formación de un enlace covalente. Preferentemente, el grupo funcional unido a la molécula de ARN es un tiol, maleimida o amina.

En otros aspectos, la invención se refiere a moléculas de ARN ligadas químicamente a aceptores de péptidos así como a las fusiones de ácido nucleico-proteína generadas por transcripción y traducción (y, si se desea, transcripción inversa y/o amplificación) de estas moléculas de ARN. En una realización, el aceptor de péptidos está ligado al extremo 3' de la molécula de ARN.

También se describen procedimientos para la selección de una proteína o ácido nucleico deseado usando las moléculas de ARN-aceptor de péptidos de la invención. Las técnicas de selección usan las moléculas de la presente invención para la formación de fusiones de ARN-proteína, y la posterior selección de proteínas... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para fijar un aceptor de péptidos a una molécula de ARN, que comprende:

(a) proporcionar una molécula de ARN; y

(b) ligar químicamente dicho aceptor de péptidos a dicha molécula de ARN para formar un enlace covalente.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho aceptor de péptidos se une a un resto de psoraleno y dicha etapa de ligación química comprende entrecruzar dicho aceptor de péptidos, a través de dicho resto de psoraleno, con dicha molécula de ARN.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho resto de psoraleno se une a dicho aceptor de péptidos a través de un engarce.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho resto de psoraleno se sitúa en el extremo 5' de dicho engarce.

5. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho resto de psoraleno se sitúa en el extremo 3' de dicho engarce.

6. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho resto de psoraleno se sitúa dentro de dicho engarce.

7. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho engarce comprende una cadena alquilo C6.

8. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha molécula de ARN contiene un codón de terminación colocado cerca de su extremo 3'.

9. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho engarce tiene una longitud comprendida entre 25 y 40 unidades nucleotídicas.

10. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho entrecruzamiento se consigue por irradiación de luz UV.

11. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que, antes de dicho entrecruzamiento, dicho ARN se hibrida con dicho engarce que comprende además un resto fotoescindible, y dicho ARN hibridado se inmoviliza en un soporte sólido a través de dicho resto fotoescindible.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicho resto fotoescindible es biotina.

13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha molécula de ARN se funcionaliza, y en el que se une un grupo funcional a dicho aceptor de péptidos.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha molécula de ARN se funcionaliza por oxidación con IO4.

15. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha ligación química se realiza en ausencia de un molde externo.

16. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicho aceptor de péptidos está unido covalentemente a una molécula de engarce y, antes de dicha etapa de ligación química, dicha molécula de ARN y dicho aceptor de péptidos se alinean usando un molde externo, hibridando dicho molde externo con el extremo 3' de dicha molécula de ARN y con el extremo 5' de dicha molécula de engarce.

17. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicho aceptor de péptidos se une covalentemente a una molécula de engarce y, antes de dicha etapa de ligación química, dicha molécula de ARN y dicho aceptor de péptidos se alinean por hibridación de dicha molécula de engarce al extremo 3' de dicho ARN.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicho grupo funcional de dicho aceptor de péptidos se localiza en el extremo 5' de dicha molécula de engarce.

19. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicho grupo funcional de dicho aceptor de péptidos está flanqueado por una región que hibrida con dicha molécula de ARN por un lado y por dicho aceptor de péptidos por el otro lado.

20. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicho grupo funcional de aceptor de péptidos se selecciona entre el grupo que consiste en una amina, hidrazina, (tio) hidrazida y (tio) semicarbazona.

21. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha etapa de ligación química comprende:

(a) unir un grupo funcional a dicha molécula de ARN mediante aminación reductora;

(b) modificar un aceptor de péptidos para que reaccione con dicho grupo funcional de dicha molécula de ARN; y

(c) poner en contacto dicho aceptor de péptidos con dicha molécula de ARN en condiciones que permiten la formación de enlaces covalentes.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que dicho grupo funcional es un tiol, una maleimida o una amina.

23. El procedimiento de la reivindicación 1 o 22, en el que dicha molécula de ARN comprende una secuencia de inicio de la traducción y un codón de iniciación unido operativamente a una secuencia codificante de proteína.

24. El procedimiento de la reivindicación 1 o 22, en el que dicho aceptor de péptidos es puromicina.

25. El procedimiento de la reivindicación 1 o 22, en el que dicho aceptor de péptidos está unido covalentemente a una molécula de engarce no nucleotídica.

26. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho engarce comprende espaciadores de trietilenglicol.

27. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho engarce comprende 2'-OMe-ARN fosforamiditas.

28. El procedimiento de la reivindicación 1, 3 o 22, en el que dicho ARN o dicho engarce contienen una secuencia de purificación de afinidad y dicho procedimiento comprende además purificar dicho ARN.

29. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que dicha secuencia de purificación de afinidad comprende una secuencia de poli (A) .

30. Una molécula de ARN entrecruzada con un aceptor de péptidos a través de un resto de psoraleno.

31. La molécula de ARN de la reivindicación 30, en la que dicho ARN contiene un codón de terminación colocado en su sitio diana de fotoentrecruzamiento.

32. La molécula de ARN de la reivindicación 30, en la que dicho aceptor de péptidos está ligado al extremo 3' de dicha molécula de ARN.

33. La molécula de ARN de la reivindicación 30, en la que dicha molécula de ARN comprende una secuencia de inicio de la traducción y un codón de iniciación unido operativamente a una secuencia codificante de proteína.

34. La molécula de ARN de la reivindicación 30, en la que dicho aceptor de péptidos es puromicina.

35. La molécula de ARN de la reivindicación 30, en la que dicho resto de psoraleno está unido a dicho aceptor de péptidos a través de un engarce.

36. Un procedimiento para generar una fusión de ARN-proteína, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) proporcionar una molécula de ARN hibridada con un engarce, comprendiendo dicho engarce un resto fotoescindible, un resto de psoraleno y un aceptor de péptidos;

(b) inmovilizar dicho ARN en un soporte sólido en condiciones en las que el ARN no inmovilizado se retira sustancialmente del soporte;

(c) entrecruzar dicho aceptor de péptidos con dicho ARN, a través de dicho resto de psoraleno, con lo que dicho entrecruzamiento libera simultáneamente dicho ARN entrecruzado de dicho soporte sólido; y

(d) traducir el ARN entrecruzado formado en la etapa (c) para formar una proteína de fusión de ARN.