LIBRERÍAS DE EXPRESIÓN EN FAGO DE FRAGMENTOS VH HUMANOS.

Una biblioteca combinatoria que contiene variantes de una molécula de unión al ligando VH parental,

donde dicha molécula de unión al ligando parental comprende un fragmento VH de inmunoglobulina que contiene al menos las regiones marco (FR) de un dominio VH de inmunoglobulina y donde dichas variantes contienen al menos las regiones FR de dicho dominio VH de inmunoglobulina, y difieren de dicha molécula de unión al ligando parental en los residuos de aminoácidos que constituyen parte de al menos una de las CDR de dicha molécula de unión al ligando parental, donde dicho dominio VH de inmunoglobulina se describe en la SEC. ID Nº: 87 u 88.

Librerías de expresión en fago de fragmentos VH humanos Campo de la invención La presente invención se refiere a bibliotecas combinatorias que incluyen bibliotecas de expresión en fago que expresan fragmentos de unión con un único dominio de cadena pesada, que tienen las características de solubilidad preferidas.

Antecedentes de la invención Los desarrollos en las tecnologías de genomanipulación de anticuerpos e ingeniería genética han hecho posible la generación de formas de fragmentos de anticuerpos recombinantes las cuales, en muchos casos, son sustitutos funcionales de moléculas de inmunoglobulina intactas más grandes. Los fragmentos de anticuerpos con un solo dominio pesado ("dAb') han sido el tema de varios reportes en la bibliografía de patentes y científica. La bibliografía publica esfuerzos por generar bibliotecas de expresión en fago de dichos fragmentos para la selección de fagos por afinidad frente a un ligando diana.

La patente de los Estados Unidos Nº 5, 702, 892 ('892) da a conocer una biblioteca de expresión en fago construida en un vector de expresión derivado de M13, en la cual un fago recombinante de la biblioteca contiene un polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende una proteína de recubrimiento del fago y un fragmento de unión de cadena pesada de inmunoglobulina. El fragmento de unión a la cadena pesada se extiende desde una pisición secuencia arriba de CDR1 hasta una posición secuencia abajo de CDR3. La patente '892 describe que la secuencia de ADN que codifica la región CDR3 y/o la región CDR1 puede ser variada al azar de modo que la población de fagos exprese una serie de dominios de unión de cadena pesada potenciales, para la selección por afinidad frente al ligando diana. La patente de los Estados Unidos Nº 5, 759, 808 da a conocer una biblioteca de expresión en fago que comprende una población de fagos basada en una variación al azar de una secuencia de ADNc obtenida de linfocitos de camélidos inmunizados previamente con antígenos diana. Los anticuerpos de cadena pesada de camélidos existen naturalmente, en una composición de aproximadamente 45%, como dímeros de cadena pesada. Los anticuerpos de cadena pesada específicos para un antígeno diana pueden ser generados mediante inmunización de un miembro de la especie camélida con el antígeno diana (véase Lauwereys et al. (1998) The EMBO J. 17, 3512-3520) .

Hamers-Casterman et al. (1993) Nature 363, 446-448 informan que los anticuerpos de cadena pesada de los camélidos son naturalmente más hidrófilos en los residuos de aminoácidos de las posiciones 44, 45 y 47 (sistema de numeración de Kabat) , en FR2, la cual corresponde a la superficie donde ellos normalmente toman contacto con el dominio VL. Otra característica destacable de un VH de camélido es que generalmente tiene una CDR3 comparativamente más larga con una alta incidencia de cisteínas y por lo tanto puede formar, a través de cisteínas apareadas en CDR1 y CDR3, bucles expuestos, que son más manejables para la unión dentro de cavidades como el sitio activo de las enzimas y los anticuerpos (Desmyter et al. (1996) Nat. Struct. Biol. Vol. 3, Nº 9, p. 803) . Sin embargo, se ha cuestionado si anticuerpos de un solo dominio con las afinidades deseadas pueden ser generados con dichas configuraciones en ausencia de una inmunización previa, es decir con una biblioteca naive (no inmune) (Lauwereys et al. (1998) supra) .

Davies y Riechmann (Protein Engineering vol. 9, Nº 6, pp. 531-537, 1996) describen un procedimiento de camelización en dos pasos de dominios VH humanos. Los puntos de fusión de los dominios VH se determinaron en experimentos de termodesnaturalización.

La presente invención da a conocer avances en la tecnología relacionada con la creación de bibliotecas que contienen proteínas análogas a la inmunoglobulina que se unen específicamente a ligandos diana por ej. antígenos.

Resumen de la invención La presente invención se define en las reivindicaciones.

De acuerdo con un aspecto, la invención apunta a bibliotecas combinatorias que contienen variantes de una molécula de unión al ligando VH parental, donde dicha molécula de unión al ligando parental comprende un fragmento VH de inmunoglobulina que contiene al menos las regiones marco (FR) de un dominio VH de inmunoglobulina y donde dichas variantes contienen al menos las regiones FR de dicho dominio VH de inmunoglobulina, y difieren de dicha molécula de unión al ligando parental en los residuos de aminoácidoss que constituyen parte de al menos una de las CDR de dicha molécula de unión al ligando parental, donde dicho dominio VH de inmunoglobulina se describe en la SEC. ID Nº : 87 u 88.

Además de una biblioteca de moléculas de ácido nucleico, el término biblioteca de expresión se entiende que incluye específicamente un fago, viral, bacteriano u otra biblioteca de expresion en superficie celular, una biblioteca de

expresión en ribosoma o cualquier otro sistema de expresión de ácido nucleico funcional que permita la expresión de productos para ser cribados.

De acuerdo con otro aspecto, la invención apunta a un método para generar una biblioteca de expresión de VH que tenga una diversidad de secuencias CDR, donde dicho método comprende:

(a) proporcionar vectores de expresión que comprendan una secuencia de ácido nucleico que codifique un VH, donde dicho VH se define como la variante definida en la reivindicación 1; (b) introducir mediante mutagénesis una variación en una secuencia de ácido nucleico de CDR; y (c) recuperar una biblioteca de expresión que tenga una diversidad de actividades de unión, donde dicho VH es un VH humano.

En este documento también se describe una biblioteca de expresión que expresa polipéptidos que comprenden Vs, donde dicha biblioteca comprende un conjunto de regiones marco que tienen una diversidad de secuencias CDR, donde dicha biblioteca tiene una diversidad de actividades de unión, donde dichas regiones marco contienen uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos de un grupo que comprende, 6-A, 23-A, 82a-N, 93-A y 108-Q. También se describe un método para identificar a un polipéptido que contiene un VH, que se une a un ligando diana, donde dicho método comprende los pasos de cribar miembros polipeptídicos de esta biblioteca de expresión recién mencionada con respecto a su capacidad para unirse al ligando diana; e identificar al menos un miembro polipeptídico que se una al ligando diana.

También se describe un polipéptido que contiene un VH, donde dicho polipéptido deriva de una biblioteca de acuerdo con cualquiera de los párrafos precedentes.

También se describe una población de variantes de al menos una molécula de unión al ligando VH (dAb) , donde dicha molécula de unión al ligando VH parental comprende un fragmento de unión VH de inmunoglobulina que comprende, al menos en gran parte, al menos las regiones marco (FR) del fragmento VH de inmunoglobulina descrito en la figura 2, donde dichas variantes comprenden al menos en gran parte, las regiones FR del fragmento VH de inmunoglobulina descrito en la figura 2, que incluye al menos uno de (y preferentemente todos) los residuos de aminoácidos, 6, 23, 82a, 93 y 108, y que difieren de dicha molécula de unión al ligando parental en los residuos de aminoácidos que constituyen al menos parte de al menos una de las CDR de dicha molécula de unión al ligando parental. Dicha población de variantes puede estar constituida por una o más bibliotecas combinatorias de dichas variantes, por ejemplo, micromatrices multigénicas (genochips) , bibliotecas de expresión en fago, bibliotecas de expresión en ribosoma, etc.

Se debe comprender que las variantes pueden (aunque no necesariamente) formar parte de otra estructura o molécula, por ejemplo en el caso de la expresión en fago, parte de la proteína de recubrimiento del fago. Concordantemente, el término variante se usa ampliamente para referirse a las variantes de la molécula esencial (una molécula que se une a un ligando) cuando forma parte de otra estructura o moléculas (por ej. como en la expresión en fago o la expresión en ribosoma) o cuando es independiente de cualquiera de dichas combinaciones, por ej. en el caso de micromatrices antigénicas cuyos miembros pueden no estar asociados a moléculas/estructuras de soporte individuales.

De acuerdo con la invención, dicha molécula de unión al ligando VH parental y dichas variantes comprenden cada uno de los residuos de aminoácidos 6, 23, 82a, 93 y 108, descritos en la figura 2 y preferentemente... [Seguir leyendo]

1. Una biblioteca combinatoria que contiene variantes de una molécula de unión al ligando VH parental, donde dicha molécula de unión al ligando parental comprende un fragmento VH de inmunoglobulina que contiene al menos las regiones marco (FR) de un dominio VH de inmunoglobulina y donde dichas variantes contienen al menos las regiones FR de dicho dominio VH de inmunoglobulina, y difieren de dicha molécula de unión al ligando parental en los residuos de aminoácidos que constituyen parte de al menos una de las CDR de dicha molécula de unión al ligando parental, donde dicho dominio VH de inmunoglobulina se describe en la SEC. ID Nº : 87 u 88.

2. Una biblioteca de acuerdo con la reivindicación 1, donde dichas variantes incluyen la totalidad de la CDR1 y la CDR2 del dominio VH de SEC. ID Nº : 87 u 88.

3. Un método para generar una biblioteca de expresión de VH que tenga una diversidad de secuencias CDR, donde dicho método comprende:

(a) proporcionar vectores de expresión, donde dichos rectores comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un VH, dicho VH se define como la variante definida en la reivindicación 1;

(b) introducir mediante mutagénesis una variación en una secuencia de ácido nucleico CDR; y

(c) recuperar una biblioteca de expresión que tenga una diversidad de actividades de unión donde dicho VH es VH humano.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde los VH tienen diversidad de CDR sólo en las secuencias CDR3.

5. Un método para identificar un polipéptido que comprende un VH que se une al ligando diana, que comprende los pasos de:

(a) cribar miembros polipeptídicos de la biblioteca de la reivindicación 1 o 2 para determinar su capacidad para unirse preferencialmente al ligando diana; e

(b) identificar al menos un miembro polipeptídico que se una al ligando diana.

6. Un dominio de inmunoglobulina que comprende una variante de una molécula de unión al ligando VH parental, donde dicha molécula de unión al ligando parental comprende un fragmento VH de inmunoglobulina que contiene al menos las regiones FR del dominio VH de inmunoglobulina de SEC. ID Nº : 87 y donde dichas variantes comprenden al menos las regiones FR del dominio VH de inmunoglobulina de SEC. ID Nº : 87 y difieren de dicha molécula de unión al ligando parental en los residuos de aminoácidos que constituyen al menos parte de al menos una de las CDR de dicha molécula de unión al ligando parental.

7. Dominio de inmunoglobulina de acuerdo con la reivindicación 6, donde dichas variantes difieren de dicha molécula de unión al ligando parental en los aminoácidos que constituyen al menos parte de la CDR3.

Figuras Figura 1

Figura 1 (continuación) Figura 2 Figura 2 (continuación)

Figura 3 Estructura del dominio VH del anticuerpo A6 humano Figura 3 (continuación)

Figura 4 Estructura del dominio VH del anticuerpo A6 humano. Los nucleótidos mutados que abarcan los residuos 7-48 para Figura 4 (continuación) Figura 5 Figura 6

Figura 7 Figura Figura 7

Figura 8 Estructura del dominio VH modificado del anticuerpo A6 humano que muestra sustituciones en las posiciones 44, 45, Figura 8 (continuación) Figura 9

Figura 10

Secuencia A6VH para la biblioteca A6VH-L1 5 mutaciones (en engritas) Aleatorización e.

100. n

Figura 11 Secuencia A6VH para la biblioteca A6VH-L1a 5 mutaciones (en engritas.

100. n eliminados