Procedimiento para la purificación de polipéptidos recombinantes.

Un procedimiento para la preparación de un polipéptido recombinante de interés,

que comprende

(i) fermentación de una célula huésped procariótica que comprende un periplasma y que está transformadacon un sistema de expresión recombinante capaz de producir la secreción de un polipéptido de interés en elperiplasma de dicha célula huésped, donde dicha ferment ación se realiza en un medio de fermentación bajocondiciones tales que el polipéptido de interés se secrete al periplasma de la célula huésped, y(ii) extracción del polipéptido de interés del periplasma aplicando un choque osmótico a las células huéspedcontenidas en el medio de fermentación,

en el que dicho choque osmótico se realiza mediante la adición de sacarosa directamente al medio de fermentacióny la posterior dilución con H2O de modo que la membrana celular externa de la célula huésped se rompasuficientemente para liberar el contenido de su periplasma en el medio de fermentación.

Procedimiento para la purificación de polipéptidos recombinantes

Esta invención trata de un método para la preparación de un polipéptido recombinante de interés, polipéptido que durante la expresión se ha secretado en el periplasma de una célula huésped transformada.

En particular, esta invención trata de métodos para preparar y purificar un interferón a2 humano recombinante.

Pueden producirse polipéptidos o proteínas, como interferones del grupo del interferón a2, mediante tecnología de DNA recombinante usando células bacterianas (p. ej. Escherichia coli) como huéspedes. Así, las células bacterianas pueden transformarse con DNA plasmídico que codifica dicho polipéptido. De ese modo, se permite que las bacterias expresen cantidades del polipéptido bien en el citoplasma o bien en el periplasma. Como las bacterias pueden desarrollarse en grandes cantidades usando procedimientos de fermentación a gran escala, de este modo es posible producir grandes cantidades del polipéptido.

Aunque pueden emplearse técnicas recombinantes para producir altos rendimientos de un polipéptido bruto de interés, el aislamiento y la purificación del polipéptido no es un asunto simple. En un procedimiento de aislamiento típico, un caldo de fermentación se neutraliza, por ejemplo mediante acidificación o calentamiento. Posteriormente, las células bacterianas se retiran para dejar un sobrenadante líquido, que contiene subproductos solubles no deseados, que se descarta. La masa de células bacterianas resultante se resuspende en un medio apropiado, p. ej. un tampón adecuado, y las células se rompen para extraer y aislar el interferón bruto. Este laborioso procedimiento se lleva a cabo a fin de separar el polipéptido de interés de tantos subproductos de fermentación y otros contaminantes como sea posible para asegurar que las etapas de purificación posteriores (que implican la separación cromatográfica) avancen de un modo tan eficaz como sea posible.

La naturaleza laboriosa de este procedimiento de la técnica anterior puede conducir a rendimientos inferiores de polipéptido de interés extraído y costes de producción superiores. De acuerdo con esto, sigue habiendo una necesidad de un procedimiento que permita la preparación de un polipéptido recombinante de interés a partir de células bacterianas de un modo productivo y económico.

Ejemplos de procedimientos de la técnica anterior son como sigue:

Hart et ál. describen el aislamiento in situ de IGF-I periplásmico de E. coli. El IGF-I se solubilizaba mediante caótropos y reductores bajo condiciones alcalinas (Hart, R.A., Lester, P.M., Reifsny der, D.H., et ál. (1994) . Bio/Technology, vol. 12, pp. 1113-1117) . Se diseñaba un sistema bifásico acuoso para mejorar la centrifugación posterior y el rendimiento de recuperación.

Dalmora et ál. describen el uso de choque osmótico en un procedimiento analítico a pequeña escala (Dalmora et ál. (1997) . Journal of Chromatography A, vol. 782, pp. 199-210) . Antes de aplicar un choque osmótico, las células se separaban del caldo de fermentación mediante centrifugación.

En el contexto de la presente invención se ha encontrado sorprendentemente que es posible una extracción y un aislamiento eficaz de un polipéptido recombinante de interés, por ejemplo de un interferón a2 recombinante, de una célula huésped que comprende un periplasma, como una célula bacteriana gramnegativa, realizando directamente un choque osmótico sobre las células huésped que comprenden un polipéptido recombinante de interés expresado en su periplasma, omitiendo de ese modo las susodichas etapas de separación y resuspensión. Al realizar tal procedimiento la membrana celular externa de la célula huésped se rompe suficientemente para liberar el contenido de su periplasma al medio de fermentación.

Por lo tanto, puede evitarse la liberación de material citoplásmico no deseado, p. ej. proteínas y DNA de las células huésped, en la fracción de residuo celular. Sorprendentemente, la purificación cromatográfica posterior no se compromete, sino que conduce fácilmente a rendimientos y/o pureza superiores del polipéptido recombinante que va a aislarse.

En el contexto de la presente invención, se ha encontrado además que una secuencia única de etapas cromatográficas, en particular si se combina con el susodicho procedimiento de extracción / ruptura, conduce a rendimientos y/o pureza superiores de un interferón a2 recombinante.

De acuerdo con esto, en un aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para la preparación de un polipéptido recombinante de interés, que comprende

(i) fermentación de una célula huésped procariótica que comprende un periplasma y que está transformada con un sistema de expresión recombinante capaz de producir la secreción de un polipéptido de interés en el

periplasma de dicha célula huésped, donde dicha fermentación se realiza en un medio de fermentación bajo condiciones tales que el polipéptido de interés se secrete al periplasma de la célula huésped,

(ii) extracción del polipéptido de interés del periplasma aplicando un choque osmótico a las células huésped contenidas en el medio de fermentación,

en el que dicho choque osmótico se realiza mediante la adición de sacarosa directamente al medio de fermentación y la posterior dilución con H2O de modo que la membrana celular externa de la célula huésped se rompa suficientemente para liberar el contenido de su periplasma en el medio de fermentación.

Sistemas de expresión periplásmica recombinantes adecuados, en particular vectores de expresión, y células huésped procarióticas correspondientes así como métodos de fermentación apropiados son muy conocidos en la técnica. Ejemplos adecuados se describen posteriormente en la sección de Ejemplos.

En una de sus realizaciones preferidas, dicho choque osmótico se realiza mediante la adición de un agente directamente al medio de fermentación, donde dicho agente es capaz de crear después de la dilución con H2O una presión osmótica que conduce a la rotura de la membrana celular externa de la célula huésped, y la dilución posterior con H2O.

El agente es de sacarosa. Opcionalmente, un componente formador de complejos, como EDTA, puede añadirse adicionalmente al medio de fermentación.

El agente está presente en tal concentración que, durante la dilución del medio de fermentación con H2O, se produce un choque osmótico que conduce a la ruptura de la membrana celular externa de la célula huésped con la liberación posterior del polipéptido de interés expresado.

En particular, en una realización preferida adicional de la presente invención, la concentración de la sacarosa en el medio de fermentación cuando comienza la dilución es aproximadamente 20% en peso/volumen. Preferiblemente, el factor de dilución del caldo de fermentación que contiene sacarosa con H2O es al menos 3 veces.

En el contexto de la presente invención, una célula huésped procariótica preferida que comprende un periplasma es una bacteria gramnegativa. Preferiblemente, la bacteria gramnegativa se selecciona del grupo que consiste en Escherichia coli, una especie de Pseudomonas, una especie de Enterobacter, una especie de Campylobacter y una especie de Vitreoscilla. En la realización más preferida de la presente invención, la célula huésped es E. coli.

Después de la etapa de ruptura de las células, el caldo de fermentación, que es una preparación bruta del polipéptido recombinante de interés, puede someterse a una etapa de separación, p. ej. centrifugación a alta velocidad, a fin de que el residuo celular y otra materia en partículas pueda separarse del extracto que contiene el polipéptido de interés. Para ayudar en la separación de materia en partículas del extracto se prefiere añadir al caldo de fermentación antes de la etapa de separación un agente precipitante adecuado. En el contexto de la presente invención, se ha encontrado que la polietilenimina es un agente precipitante particularmente bueno para esta etapa. La polietilenimina se emplea preferiblemente a una concentración de aproximadamente 0, 05% y en un medio cuyo pH se ajusta hasta aproximadamente 7, 5, p. ej. de 7, 3 a 7, 7.

El procedimiento de la presente invención se puede utilizar en la producción de una gran variedad... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la preparación de un polipéptido recombinante de interés, que comprende

(i) fermentación de una célula huésped procariótica que comprende un periplasma y que está transformada con un sistema de expresión recombinante capaz de producir la secreción de un polipéptido de interés en el periplasma de dicha célula huésped, donde dicha fermentación se realiza en un medio de fermentación bajo condiciones tales que el polipéptido de interés se secrete al periplasma de la célula huésped, y

(ii) extracción del polipéptido de interés del periplasma aplicando un choque osmótico a las células huésped contenidas en el medio de fermentación,

en el que dicho choque osmótico se realiza mediante la adición de sacarosa directamente al medio de fermentación y la posterior dilución con H2O de modo que la membrana celular externa de la célula huésped se rompa suficientemente para liberar el contenido de su periplasma en el medio de fermentación.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la concentración de la sacarosa en el medio de fermentación cuando comienza la dilución es aproximadamente 20% en peso/volumen.

3. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que el factor de dilución del caldo de fermentación que contiene sacarosa con H2O es al menos 3 veces.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha célula huésped procariótica es una bacteria gramnegativa.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicha bacteria gramnegativa se selecciona del grupo que consiste en Escherichia coli, una especie de Pseudomonas, una especie de Enterobacter, una especie de Campylobacter y una especie de Vitreoscilla.

6. El procedimiento según la reivindicación 5, en el que la bacteria gramnegativa es E. coli.

7. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido de interés se selecciona del grupo que consiste en un interferón, una interleucina, una hormona del crecimiento, un factor de crecimiento, una citocina, una enzima, un inhibidor de enzima, un anticuerpo y un fragmento de anticuerpo.

8. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido de interés es un interferón a2.

9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que el interferón a2 se selecciona del grupo que consiste en interferón a2A e interferón a2B.