Inmunoglobulinas dirigidas contra NOGO.

Un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo capaz de unirse a la NOGO-A humana,

que comprende unaregión variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 49 y unaregión variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 14.

Inmunoglobulinas dirigidas contra NOGO

Campo de la invención

La presente invención se refiere a inmunoglobulinas, particularmente a anticuerpos que se unen a NOGO y neutralizan su actividad, a polinucleótidos que codifican tales anticuerpos, a formulaciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos y al uso de tales anticuerpos en el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades neurológicas. Otros aspectos, objetos y ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción.

Antecedentes de la Invención

En occidente, el ictus es una causa principal de muerte y discapacidad. Para el tratamiento del ictus no se ha aceptado ninguna terapia que no sea la del plasminógeno tisular (t-PA) el cual debe administrarse en las 3 horas de la aparición tras una exploración por tomografía computarizada (TC) para excluir hemorragia. Hasta ahora la mayoría de los agentes terapéuticos dirigidos hacia el tratamiento de ictus agudo (es decir, neuroprotección) , se han implicado predominantemente en dirección a receptores de glutamato y sus rutas de señalización aguas abajo que se sabe que están implicadas en la muerte celular aguda. Sin embargo hasta ahora estas estrategias se han probado sin éxito en ensayos clínicos y a menudo se asocian con efectos secundarios limitantes de la dosis (Hill & Hachinski, The Lancet, 352: (supl III) 10-14 (1998) ) . Por lo tanto existe una necesidad de nuevas estrategias dirigidas a la mejoría de la muerte celular después del cese del flujo sanguíneo. La neuroprotección es la capacidad de un tratamiento para prevenir o mejorar la pérdida de células neuronales en respuesta a una lesión o proceso de enfermedad. Esto puede conseguirse dirigiendo a las neuronas, directa o indirectamente, impidiendo la pérdida de células gliales (incluyendo oligodendrocitos) .

Tras la aparición del ictus, en algunos pacientes se observa cierto grado de recuperación funcional espontánea, lo que sugiere que el cerebro tiene la capacidad (aunque limitada) de restaurarse y/o remodelarse después de una lesión. Por lo tanto, tras la aparición de isquemia cerebral, los agentes que tienen la posibilidad de potenciar esta recuperación pueden permitir realizar la intervención mucho más tarde (posiblemente días) . Los agentes que pueden ofrecer neuroprotección aguda y potenciar la recuperación funcional pueden proporcionar ventajas significativas sobre posibles estrategias neuroprotectoras actuales.

La enfermedad de Alzheimer (EA) se caracteriza por la presencia de dos características patognomómicas. Estas son las placas amiloideas y los ovillos neurofibrilares compuestos por el péptido beta-amiloide agregado (Aβ40 y Aβ42) y la tau hiperfosforilada respectivamente (Dawbam & Allen 2001 Neurobiology of Alzheimer’s Disease OUP) .

Un estudio exhaustivo realizado en paciente ha demostrado una fuerte relación entre la acumulación de betaamiloide y el deterioro cognitivo (Naslund y col, JAMA, 22/29 de marzo del 2000, Vol.283, No, 12, pág. 15711577) . Esto coincide con estudios genéticos y epidemiológicos que sugieren que algunas mutaciones en los genes de la PPA (proteína precursora amiloidea) y de la presenilina pueden predisponer la aparición precoz de la EA, cuyas mutaciones también potencian los niveles del péptido Aβ40y Aβ42, incluyendo su proporción.

La escisión de la proteína precursora amiloidea (PPA) transmembrana de tipo I por dos proteasas distintas denominadas beta-y gamma-secretasa es necesaria para la formación del péptido beta-amiloide. Se ha confirmado la identidad molecular de la beta-secretasa como la aspartil-proteasa Asp2/BACE1 (Hussain y col Mol. Cell. Neurosci. 16, 609-619 (2000) ; Vassar y col Science (1999) , Oct, 22; 286 (5440) :735-741) . La naturaleza de la gamma-secretasa continua siendo fuente de cierto debate y probablemente consiste en un complejo de alto peso molecular que consiste al menos en las siguientes proteínas: presenilinas, Aph1, Pen2 y nicastrina (revisado en Medina y Dotti Cell Signalling 2003 15 (9) :829-41) .

El procesamiento de la PPA en el SNC probablemente sucede dentro de diversos tipos de células incluyendo neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y microglia. Aunque la tasa de procesamiento global de la PPA en estas células estará influenciada por el nivel de expresión relativo de PPA, BACE1/Asp2, presenilina-1 y -2, Aph1, Pen2 y nicastrina.

Adicionalmente, factores adicionales que regulan la localización subcelular de la PPA también pueden influir en este proceso, como se muestra mediante el hallazgo de que la mutación del motivo YENP, en el dominio citoplásmico de la PPA que bloquea su endocitosis, reduce la producción de beta-amiloide (Pérez y col 1999 J Biol Chem 274 (27) 18851-6) . La retención del CTF-beta-PPA en el RE mediante la adición del motivo de retención KRQN es suficiente para reducir la producción amiloide en células transfectadas (Maléese y col, 2001, J. Biol. Chem. 276 (23) 2026720279) . A la inversa, la elevación de endocitosis, por sobre expresión de Rab5 es suficiente para elevar la secreción amiloide de células transfectadas (Grbovic y col 2003 J Biol Chem 278 (33) 31261-31268) .

Coherente con estos descubrimientos estudios posteriores han demostrado que la reducción celular de niveles de colesterol (un factor de riesgo bien conocido para la AD) reduce la formación del beta-amiloide. Este cambio era dependiente de una endocitosis modificada como se demuestra mediante el uso de mutantes dinámicos dominantes

negativos (K44A) y la sobreexpresión de la proteína RN-Tre activadora de la GTPasa de Rab5 (Ehehalt y col 2003 J Cell Biol 160 (1) 113-123) .

Los microdominios o plataformas (rafts) ricos en colesterol son también un sitio celular importante de producción de beta-amiloide y se ha observado que la PPA, BACE1 y todos los componentes del complejo gamma-secretasa residen transitoriamente en las plataformas (rafts) . El entrecruzamiento de anticuerpos de PPA y BACE1 contra plataformas ricas en colesterol fueron capaces de elevar la producción de beta-amiloide (Ehehalt y col 2003 J Cell. Biol. 160 (1) 113-123) . De manera similar, la expresión de BACE1 anclada a GPI, que se dirige exclusivamente contra plataformas lipídicas, es capaz de elevar la escisión de la PPA y la producción de beta-amiloide (Cordy y col 2003 PNAS 100 (20) 11735-11740) .

Actualmente se desconocen los mecanismos de recuperación funcional subyacentes después de un ictus u de otro suceso o enfermedad con daño neuronal. La proliferación de axones dañados o no se ha propuesto como un posible mecanismo. Sin embargo, aunque estudios realizados in vivo han demostrado que el tratamiento de lesiones de la médula espinal o ictus con factores neurotróficos produce una recuperación funcional y un grado de proliferación axonal potenciados, esto no demuestra ninguna relación directa entre el grado de proliferación axonal y la amplitud de recuperación funcional (Jakeman, y col. 1998, Exp. Neurol. 154: 170-184, Kawamata y col. 1997, Proc Natl Acad. Sci. USA, 94:8179-8184, Ribotta, y col. 2000, J Neurosci. 20: 5144-5152) . Adicionalmente, la proliferación axonal requiere una neurona viable. En enfermedades, tales como ictus, que están asociadas con muerte celular ampliada, la potenciación de la recuperación funcional ofrecida por un agente determinado después de ictus puede por tanto realizarse mediante mecanismos distintos de la proliferación axonal tales como diferenciación de células madre endógenas, activación de rutas redundantes, cambios en la distribución de receptores o excitabilidad de neuronas o glia (Fawcett y Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391, Homer y Gage, 2000, Nature 407 963970) .

Se piensa que la capacidad limitada del sistema nervioso central (SNC) para restaurarse después de una lesión se debe en parte a moléculas dentro del entorno del SNC que tienen un efecto inhibidor sobre la proliferación axonal (crecimiento neurítico) . Se piensa que la mielina del SNC contiene moléculas inhibidoras (Schwab ME y carona P (1988) J. Neurosci. 8, 2381-2193) . Como supuestos inhibidores del crecimiento neurítico se han clonado e identificado dos proteínas mielínicas, la glicoproteína asociada a mielina (GAM) y la NOGO (Sato S. y col (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm.163, 1473-1480; McKerracher L y col (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay G y col (1994) Neuron 13, 757-767; Torigoe K y Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262; Schafer y col (1996) Neuron 16,... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo capaz de unirse a la NOGO-A humana, que comprende una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 49 y una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 14.

2. Un anticuerpo aislado como se reivindica en la reivindicación 1 que tiene una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 55 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 18.

3. Un vector de expresión que comprende las secuencias polinucleotídicas codificantes de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

4. Una célula huésped que comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 4, cuya célula comprende un primer vector que codifica la cadena ligera y un segundo vector que codifica la cadena pesada.

6. Un procedimiento para producir un anticuerpo capaz de unirse a la NOGO-A humana, comprendiendo el procedimiento las etapas de: transfectar una célula huésped con un vector de expresión que comprenda un primer polinucleótido que codifique una región variable de la cadena pesada que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 49, y un vector de expresión que comprenda un segundo polinucleótido que codifique una región variable de la cadena ligera que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 14, y cultivar la célula huésped en condiciones que conduzcan a la secreción del anticuerpo a partir de dicha célula huésped en dicho medio de cultivo.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, que adicionalmente comprende la etapa de recuperar del medio de cultivo el anticuerpo secretado.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en el que el primer y segundo polinucleótido están contenidos en un solo vector de expresión.

9. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-NOGO o un fragmento del mismo como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, junto con un diluyente o transportador farmacéuticamente aceptable.

10. El uso de un anticuerpo anti-NOGO o un fragmento del mismo como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis del ictus y de otras enfermedades/trastornos neurológicos o para el tratamiento de un paciente que padece un traumatismo mecánico del sistema nervioso central

o periférico.

11. Un anticuerpo anti-NOGO como se reivindica en la reivindicación 1 o 2 para su uso en el tratamiento o profilaxis del ictus y de otras enfermedades/trastornos neurológicos o para el tratamiento de un paciente que padece un traumatismo mecánico del sistema nervioso central o periférico.