Un procedimiento de identificación de un citoblasto que comprende las etapas de:

proporcionar una muestra de células que incluye citoblastos; detectar la presencia de enzima conversora de angiotensina (ACE) o un fragmento de la misma que es indicativo de ACE en una célula; detectar la presencia de al menos un marcador específico de citoblastos seleccionado del grupo que incluye STRO1, SH2, SH3, SH4, citoqueratina 14, alfa-6 integrina (CD49F) y c-kit; y que es indicativo de ACE identificar los citoblastos que tienen ACE o un fragmento de la misma que es indicativo de ACE y el marcador específico de citoblastos.

Identificación y aislamiento de citoblastos somáticos y usos de los mismos [0001] La presente invención se refiere a la identificación de una población específica de tipos de células, en particular a citoblastos somáticos que incluyen citoblastos hematopoyéticos, citoblastos mesenquimatosos y queratinocitoblastos. La invención también proporciona procedimientos de aislamiento y usos de los citoblastos derivados de los procedimientos.

INTRODUCCIÓN

Existe un gran interés en identificar tipos de células específicas en un esfuerzo por obtener poblaciones enriquecidas de las células. El tener posesión de una población enriquecida puede permitir un entendimiento de los tipos específicos de células o incluso proporcionar usos en diversas situaciones que incluyen trasplante, terapia génica, tratamiento de enfermedad que incluye cánceres tales como leucemias, cánceres neoplásicos que incluyen cánceres de mama, o reparación de tejidos y piel.

Los citoblastos y el aislamiento e identificación de tales células proporcionan muchas ventajas. Estas células se definen como células que no están terminalmente diferenciadas, que pueden dividirse sin límite y que se dividen para dar células que son tanto citoblastos como que se diferencian irreversiblemente para dar un nuevo tipo de célula. Aquellos citoblastos que dan lugar a un único tipo de célula se llaman células unipotentes; aquellas que dan lugar a muchos tipos de células se llaman células pluripotentes.

Los citoblastos están por definición presentes en todos los tejidos de autorrenovación. Se cree que estas células tienen larga vida, tienen una gran posibilidad de división celular y por último lugar son responsables de la homeostasia de tejidos en estado estacionario. Los citoblastos poseen muchas de las siguientes propiedades: están relativamente sin diferenciar, ultraestructuralmente y bioquímicamente; tienen un gran potencial proliferativo y son responsables del mantenimiento y la regeneración a largo plazo de tejido; son normalmente de "ciclado lento", supuestamente para conservar su potencial proliferativo y para minimizar los errores de ADN que podrían producirse durante la replicación; pueden estimularse para proliferar en respuesta a herida y a ciertos estímulos de crecimiento; están frecuentemente localizados en estrecha proximidad a una población de células rápidamente proliferantes correspondientes a las células de amplificación transitoria ("TA") en el esquema de (1) citoblasto a (2) célula TA a (3) célula terminalmente diferenciada; y se encuentran normalmente en áreas bien protegidas, altamente vascularizadas e inervadas.

Ha sido difícil la identificación positiva de citoblastos debido a que no hay marcadores inmunológicos o bioquímicos conocidos específicos para citoblastos somáticos. Como normalmente son de "ciclo lento", los procedimientos de identificación están limitados.

Los citoblastos son dianas importantes para terapia génica, en la que los genes insertados promueven la salud del individuo al que se trasplantan los citoblastos. Además, la capacidad para aislar los citoblastos puede servir en el tratamiento de linfomas y leucemias, además de otras afecciones neoplásicas en las que los citoblastos se purifican a partir de células tumorales en la médula ósea o sangre periférica, y se reinfunden en un paciente después de quimioterapia mielosupresora o mieloablativa. Por tanto, mundialmente se han hecho esfuerzos hacia el aislamiento de citoblastos en forma sustancialmente pura.

Los citoblastos constituyen sólo un pequeño porcentaje del número total de células pluripotentes. Las células pluripotentes son identificables por la presencia de una variedad de "marcadores" de la superficie celular. Tales marcadores pueden ser tanto específicos para un linaje o célula progenitora particular como estar presentes en más de un tipo de célula. Actualmente no se sabe cuántos de los marcadores asociados a células diferenciadas también están presentes en citoblastos.

En vista de la pequeña proporción del número total de células en la médula ósea o sangre periférica que son citoblastos, ha sido difícil la incertidumbre de los marcadores asociados al citoblasto a diferencia de células más diferenciadas, y la dificultad general en ensayar citoblastos biológicamente, la identificación y purificación de citoblastos.

Los citoblastos somáticos dan lugar a células que contribuyen en último lugar a diversas partes de la planta o animal. Generalmente, las células somáticas pueden dividirse en citoblastos hematopoyéticos, mesenquimatosos o queratinocitoblastos.

Las células hematopoyéticas de mamífero son responsables de una gama extraordinariamente diversa de actividades. Se dividen en varios linajes, que incluyen linfoide, mieloide y eritroide. El linaje linfoide, que comprende linfocitos B y linfocitos T, produce anticuerpos, regula la inmunidad celular y detecta agentes extraños tales como organismos causantes de enfermedad en la sangre. El linaje mieloide, que incluye monocitos, granulocitos y megacariocitos, monitoriza la sangre para cuerpos extraños, protege contra células neoplásicas, secuestra materiales extraños y produce plaquetas. El linaje eritroide incluye glóbulos rojos, que llevan oxígeno.

La escasez relativa de citoblastos hematopoyéticos ha impedido la extensa investigación sobre citoblastos y diferenciación hematopoyética en general. La disponibilidad inmediata de una población de células enriquecida en citoblastos hematopoyéticos haría posible la identificación de modificadores biológicos que afectan el comportamiento de los citoblastos. Por ejemplo, aún puede haber factores de crecimiento sin descubrir asociados a (1) etapas tempranas de dedicación del citoblasto a un linaje particular; (2) la prevención de tal dedicación; y (3) la capacidad para controlar la proliferación de citoblastos.

La disponibilidad de números suficientes de citoblastos en una población enriquecida también sería extremadamente útil, por ejemplo, en reconstituir hematopoyesis en pacientes que están sometiéndose a tratamientos que destruyen citoblastos, tales como quimioterapia contra el cáncer.

Los citoblastos mesenquimatosos (CM) son las células pluripotentes formativas encontradas, entre otros, en médula ósea, sangre, dermis y periostio que pueden diferenciarse en más de un tipo específico de tejidos mesenquimatosos o conjuntivos (es decir, los tejidos del cuerpo que soportan los elementos especializados; por ejemplo, tejidos conjuntivos adiposos, óseos, de estroma, cartilaginosos, elásticos y fibrosos) que dependen de diversas influencias de factores bioactivos tales como citocinas. Los citoblastos mesenquimatosos (CMh) son reactivos con ciertos anticuerpos monoclonales, conocidos como SH2, SH3 y SH4.

Los queratinocitoblastos dan lugar a células de la piel y células de la epidermis. Son particularmente útiles en el tratamiento de úlceras, heridas agudas e injerto de heridas agudas.

Sin embargo, la identificación de estos tipos de células específicas por marcadores de la superficie celular ha demostrado ser generalmente el mejor medio de identificación. La identificación de antígenos de superficie celular adicionales sería claramente de gran valor en la identificación, aislamiento y posterior caracterización de citoblastos candidatos.

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es vencer o aliviar algunos de los problemas de la técnica anterior.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En un aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento de identificación de un citoblasto como se explica en la reivindicación 1.

Se ha encontrado que las secuencias de péptidos descritas en este documento como SEC ID Nº : 1 o SEC ID Nº : 2 se expresan específicamente en citoblastos. La secuencia puede ser una parte de una proteína mayor o ser una secuencia expresada por los citoblastos. Estas secuencias pueden usarse solas o en combinación para identificar o aislar citoblastos.

Los solicitantes han encontrado que la enzima conversora de angiotensina (ACE) se expresa en citoblastos. La ACE actúa convirtiendo la angiotensina-I en angiotensina-II. La angiotensina-II aumenta la tensión arterial y se considera una causa principal de hipertensión esencial. Las secuencias descritas pueden ser una parte de ACE.

Puede usarse cualquier medio de identificación de ACE.

Preferentemente, el anticuerpo es cualquier... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de identificación de un citoblasto que comprende las etapas de:

proporcionar una muestra de células que incluye citoblastos; detectar la presencia de enzima conversora de angiotensina (ACE) o un fragmento de la misma que es indicativo de ACE en una célula; detectar la presencia de al menos un marcador específico de citoblastos seleccionado del grupo que incluye STRO1, SH2, SH3, SH4, citoqueratina 14, alfa-6 integrina (CD49F) y c-kit; y que es indicativo de ACE identificar los citoblastos que tienen ACE o un fragmento de la misma que es indicativo de ACE y el marcador específico de citoblastos.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la ACE se detecta por la presencia de un péptido que tiene la secuencia LFQELQPLYL (SEC ID Nº : 1) .

3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la ACE se detecta por la presencia de un péptido que tiene la secuencia EADDFFTS (SEC ID Nº : 2) .

4. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la ACE se detecta por la presencia de un péptido que tiene la secuencia de SEC ID Nº : 1 y SEC ID Nº : 2.

5. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el citoblasto es un citoblasto hematopoyético.

6. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la detección de ACE se realiza usando un anticuerpo para ACE o un fragmento de la misma que es indicativo de ACE.

7. Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que el anticuerpo es anticuerpo BB9.

8. Un procedimiento para obtener una población de células enriquecida en citoblastos que comprende las etapas de

proporcionar una población de células que comprende citoblastos; y seleccionar células que se identifican por la presencia de ACE o un fragmento de la misma que es indicativo de ACE y al menos un marcador específico de citoblastos seleccionado del grupo que incluye STRO-1, SH2, SH3, SH4, citoqueratina 14, alfa-6 integrina (CD49F) y c-kit sobre la célula.

9. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que la ACE se detecta por la presencia de un péptido que tiene la secuencia de SEC ID Nº : 1 y/o SEC ID Nº : 2.

10. Un procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, en el que las células se seleccionan por un anticuerpo para ACE o un fragmento de la misma que es indicativo de ACE.

11. Un procedimiento según la reivindicación 10, en el que el anticuerpo es BB9.

12. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que los citoblastos son citoblastos hematopoyéticos.

13. Una población de citoblastos enriquecida preparada mediante los procedimientos según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12.

14. Un uso de una población de citoblastos según la reivindicación 13 para la preparación de una composición para el tratamiento de una afección asociada a hematopoyética en un paciente.

15. Una población de citoblastos según la reivindicación 13 para su uso en el tratamiento de una afección asociada a hematopoyética en un paciente.