Identificación de una variante de ADN asociada a hipolactasia de tipo adulto.

Una molécula de ácido nucleico que comprende una porción 5' de un gen de lactasa-florizina hidrolasa (LPH)intestinal que contribuye a o es indicativa de hipolactasia de tipo adulto,

en la que dicha molécula de ácido nucleico seselecciona del grupo consistente en

(a) una molécula de ácido nucleico que tiene o comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, lasecuencia de SEQ ID NO: 1 se exhibe también la Fig. 4 y comprendida en la secuencia como se exhibe en la FIg. 8; y

(b) una molécula de ácido nucleico que tiene o comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, lasecuencia de SEQ ID NO: 2 se exhibe también en la Fig. 5 y comprendida en la secuencia como se exhibe en la Fig. 9;

en la que dicha molécula de ácido nucleico se extiende, como máximo, 30.000 nucleótidos más allá del extremo 5' y/o 3'de la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o 2, respectivamente.

Identificación de una variante de ADN asociada a hipolactasia de tipo adulto

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende o consiste en una porción 5’ de un gen de lactasa-florizina hidrolasa (LPH) intestinal que contribuye a, o es indicativa de, hipolactasia de tipo adulto, en la que dicha molécula de ácido nucleico se caracteriza por las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención se refiere adicionalmente a procedimientos para ensayar la presencia de o la predisposición a hipolactasia de tipo adulto que están basados en el análisis de un SNP contenido en la molécula de ácido nucleico anteriormente indicada. Adicionalmente, la presente invención se refiere a una composición de diagnóstico y a un kit útiles para la detección de la presencia de o la predisposición a hipolactasia de tipo adulto.

La enzima lactasa-florizina hidrolasa (LPH) , que se expresa exclusivamente por células epiteliales intestinales, hidroliza la lactosa, o azúcar de la leche, a glucosa y galactosa1. La expresión de la enzima LPH se reduce drásticamente a niveles muy bajos en el periodo de destete de mamíferos cuando la lactosa ya no es una parte esencial de la dieta. En seres humanos, la afección conocida como hipolactasia de tipo adulto o no persistencia de lactasa, afecta a la mayoría de poblaciones y limita gravemente el uso de leche fresca entre los adultos debido a la intolerancia a la lactosa. La edad de inicio del estado de no persistencia de lactasa varía entre las poblaciones, estando en el intervalo de 1-2 años de edad entre los tailandeses hasta 10-20 años de edad entre los finlandeses2-3. Sin embargo, en el norte de Europa y otros pocos grupos étnicos, la actividad de LPH persiste a lo largo de la vida en la mayoría de los adultos, una afección conocida como persistencia de lactasa. El fenotipo de persistencia/no persistencia de lactasa se ha mostrado que está determinado genéticamente, siendo el estado persistente dominante frente al estado no persistente4-6 .

El diagnóstico del estado de la técnica de hipolactasia de tipo adulto está basado en el ensayo de tolerancia a lactosa (ETL) . Después de un ayuno de una noche (10 horas) , se administra 1 g/kg de lactosa en forma de una solución al 12, 5%, siendo la dosis máxima de 50 g. Se toman muestras de sangre capilar antes y 20 y 30 min después de la ingestión de lactosa. Se determina la concentración de glucosa mediante el procedimiento de glucosa oxidasa (Hjelm y de Verdier, 1963) . Se observan los síntomas abdominales el día del ETL. Se tomó una elevación máxima de la concentración sanguínea de glucosa de 1, 1 mmol/l o más como signo de malabsorción de lactosa (Gudman-Hoyer y Hamum 1968, Jussila 1970, Sahi 1972) . El ETL contiene un riesgo de un 10% de diagnósticos falsos positivos y negativos, concretamente, la sensibilidad y especificidad del ETL es de aproximadamente un 90% (Isokoski et al. 1972, Newcomer et al., 1975, Sahi 1983) . La exactitud del ETL pude mejorarse administrando 0, 3 g/kg de etanol, que inhibe el metabolismo de galactosa en el hígado (Tygstrup y Lundqvist, 1962) , y 15 min después 1 g/kg de lactosa en forma de una solución al 12, 5%.

Los niños con elevaciones máximas de menos de 0, 2 mg/100 ml en el primer ETL o repetido se han enviado a biopsia de intestino delgado, que se toma mediante gastroscopia. Este es un procedimiento invasivo que requiere experiencia y se efectúa habitualmente en hospitales universitarios solo por especialistas en gastroenterología. Las muestras de biopsia se examinan con un microscopio de disección e histológicamente, y se determinan las actividades maltasa, sacarasa y lactasa de mucosa (Launiala et al., 1964) . El diagnóstico de hipolactasia en niños se justifica si la histología de la biopsia intestinal es normal y la actividad lactasa es menor de 20 U/g de proteína y la relación de lactasa/sacarasa es menor de 0, 30, o en ETL con administración de etanol, si se demuestra una elevación máxima de la concentración sanguínea de glucosa de menos de 20 mg/100 ml y de la concentración de galactosa de 5 mg/100 ml o menos (Sahi et al., 1972) . Como se describe anteriormente, los procedimientos actuales para diagnosticar hipolactasia de tipo adulto son laboriosos. El ETL es inexacto y, por lo tanto, se requiere un procedimiento invasivo, la gastroscopia, antes de establecer el diagnóstico. Puesto que la hipolactasia de tipo adulto es muy común y la causa principal de síntomas abdominales no específicos (en un tercio de los pacientes que se quejan de dolor de estómago) , existe la clara necesidad de mejorar el diagnóstico de este problema sanitario común.

Sin embargo, hasta ahora no se ha desarrollado ningún ensayo bioquímico que sea fácil de manejar y que, al mismo tiempo, proporcione resultados rápidos y exactos. La dilucidación de la causa de la enfermedad al nivel de expresión de ADN genómico ha sido igualmente fallida. Por tanto, la secuenciación de las regiones codificantes y promotoras del gen LPH en adultos no ha revelado variaciones de ADN que se correlacionen con la persistencia-no persistencia de lactasa, ni han surgido evidencias de variantes de corte y empalme ni variantes de edición de ARNm asociadas a este rasgo7-8 . Estudios previos han mostrado que el rasgo de persistencia/no persistencia de lactasa está posiblemente controlado por un elemento o elementos de acción en cis que residen en o son adyacentes al gen de lactasa, y se ha observado un fuerte desequilibrio de ligamiento (DL) en el haplotipo de 70 kb que se extiende por el gen de lactasa9-10. Varios estudios reseñan evidencias de que el control principal de la expresión del gen LPH opera al nivel de regulación de la transcripción11-13. Sin embargo, se ha sugerido que puede estar implicada en la etiología de hipolactasia de tipo adulto una variación que influye tanto en el control transcripcional como postranscripcional de la expresión del gen LPH14-15 .

A la vista de lo anterior, el problema técnico subyacente de la presente invención era proporcionar medios y procedimientos que permitieran un diagnóstico exacto y conveniente de hipolactasia de tipo adulto o de una predisposición a esta enfermedad.

La solución a dicho problema técnico se logra mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Por tanto, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende o consiste en una porción 5’ de un gen de lactasa-florizina hidrolasa (LPH) intestinal que contribuye a o es indicativa de hipolactasia de tipo adulto, en la que dicha molécula de ácido nucleico se caracteriza por las reivindicaciones adjuntas.

De acuerdo con la invención, el término “gen de lactasa-florizina hidrolasa (LPH) intestinal” denota un gen que codifica una enzima que tiene actividad de hidrólisis de lactosa en sus componentes glucosa y galactosa. La enzima se caracteriza como E.C. 3.2.1.23.62.

El término “hipolactasia de tipo adulto” designa una afección, también conocida como intolerancia a la lactosa, que es una afección recesiva autosómica resultante de la reducción “fisiológica” de la actividad de la enzima lactasa-florizina hidrolasa (LPH) en las células intestinales de una proporción significativa de la población mundial.

El término “contribuye a o es indicativo de hipolactasia de tipo adulto” designa el hecho de que los SNP, y por tanto las correspondientes moléculas de ácido nucleico, encontrados son indicativos de la afección y posiblemente también causantes de la misma. Por consiguiente, este término requiere necesariamente que la porción 5’ indicada sea indicativa de la afección. Por otro lado, dicho término no requiere necesariamente que la porción 5’ sea causante de o contribuya a la afección. Sin embargo, dicho término no excluye un papel causante o contribuyente de cualquiera o ambos SNP.

El término “que hibrida en condiciones rigurosas” designa condiciones de hibridación que son bien conocidas o que pueden establecerse por el especialista en la materia según protocolos convencionales. El término designa lo más ventajosamente las condiciones altamente rigurosas. Pueden establecerse las condiciones rigurosas apropiadas para cada secuencia basándose en parámetros bien conocidos tales como temperatura, composición de las moléculas de ácido nucleico, condiciones salinas, etc., véanse, por ejemplo: Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laborator y Manual"; CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989 o Higgins... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una porción 5’ de un gen de lactasa-florizina hidrolasa (LPH) intestinal que contribuye a o es indicativa de hipolactasia de tipo adulto, en la que dicha molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo consistente en

(a) una molécula de ácido nucleico que tiene o comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, la secuencia de SEQ ID NO: 1 se exhibe también la Fig. 4 y comprendida en la secuencia como se exhibe en la FIg. 8; y

(b) una molécula de ácido nucleico que tiene o comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, la secuencia de SEQ ID NO: 2 se exhibe también en la Fig. 5 y comprendida en la secuencia como se exhibe en la Fig. 9;

en la que dicha molécula de ácido nucleico se extiende, como máximo, 30.000 nucleótidos más allá del extremo 5’ y/o 3’ de la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o 2, respectivamente.

2. Una molécula de ácido nucleico consistente en una porción 5’ de un gen de lactasa-florizina hidrolasa (LPH) intestinal que contribuye a o es indicativa de hipolactasia de tipo adulto, en la que dicha molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo consistente en

(a) una molécula de ácido nucleico de al menos 20 nucleótidos, cuya hebra complementaria hibrida en condiciones rigurosas con una molécula de ácido nucleico que tiene o comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, en la que dicho polinucleótido tiene en la posición correspondiente a la posición -13910 en 5' del primer ATG del gen LPH un residuo de citosina; y

(b) una molécula de ácido nucleico de al menos 20 nucleótidos, cuya hebra complementaria hibrida en condiciones rigurosas con una molécula de ácido nucleico que tiene o comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, en la que dicho polinucleótido tiene en la posición correspondiente a la posición -22018 en 5' del primer ATG del gen LPH un residuo de guanina;

en la que dicha molécula de ácido nucleico se extiende, como máximo, 30.000 nucleótidos más allá del extremo 5’ y/o 3’ de la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o 2, respectivamente.

3. Una molécula de ácido nucleico que comprende una porción 5’ de un gen de lactasa-florizina hidrolasa (LPH) intestinal en la que dicha molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo consistente en

(a) una molécula de ácido nucleico que tiene o comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3; la secuencia de SEQ ID NO: 3 se exhibe también en la Fig. 6;

(b) una molécula de ácido nucleico que tiene o comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4; la secuencia de SEQ ID NO: 4 se exhibe también en la Fig. 7.

4. Una molécula de ácido nucleico consistente en una porción 5’ de un gen de lactasa-florizina hidrolasa (LPH) intestinal, en la que dicha molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo consistente en:

(a) una molécula de ácido nucleico cuya hebra complementaria hibrida en condiciones rigurosas con una molécula de ácido nucleico que tiene o comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3, en la que dicha molécula de ácido nucleico tiene en la posición correspondiente a la posición 13910 del primer ATG del gen LPH un residuo de timidina; y

(b) una molécula de ácido nucleico cuya hebra complementaria hibrida en condiciones rigurosas con una molécula de ácido nucleico que tiene o comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4, en la que dicha molécula de ácido nucleico tiene en la posición correspondiente a la posición 22018 del primer ATG del gen LPH un residuo de adenosina.

5. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que es ADN genómico.

6. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5, en la que dicho ADN genómico es parte de un gen.

7. Un fragmento de la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que tiene al menos 14 nucleótidos, en el que dicho fragmento comprende la posición nucleotídica -13910 o la posición nucleotídica 22018 del gen LPH.

8. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria de la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 y 5 a 7

9. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria de la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7

10. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 y 5 a 7.

11. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7.

12. Un cebador o par de cebadores, en el que el cebador o par de cebadores hibrida en condiciones rigurosas con la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 y 5 a 7 que comprende la posición nucleotídica -13910 del gen LPH o con la hebra complementaria de la misma, en el que el cebador es exactamente complementario de una secuencia que contiene C en la posición -13910 o con la hebra complementaria de la misma.

13. Un cebador o par de cebadores, en el que el cebador o par de cebadores hibrida en condiciones rigurosas con la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 y 5 a 7 que comprende la posición nucleotídica -22018 del gen LPH o con la hebra complementaria de la misma, en el que el cebador es exactamente complementario de una secuencia que contiene G en la posición -22018 o con la hebra complementaria de la misma.

14. Un cebador o par de cebadores, en el que el cebador o par de cebadores hibrida en condiciones rigurosas con la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 que comprende la posición nucleotídica 13910 del gen LPH o con la hebra complementaria del mismo, en el que el cebador es exactamente complementario de una secuencia que contiene T en la posición -13910 o con la hebra complementaria de la misma.

15. Un cebador o par de cebadores, en el que el cebador o par de cebadores hibrida en condiciones rigurosas con la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 que comprende la posición nucleotídica 22018 del gen LPH o con la hebra complementaria de la misma, en el que el cebador es exactamente complementario de una secuencia que contiene A en la posición -22018 o con la hebra complementaria de la misma.

16. Un hospedador no humano transformado con el vector de la reivindicación 10.

17. Un hospedador no humano transformado con el vector de la reivindicación 11.

18. El hospedador no humano de la reivindicación 16 o 17 que es una bacteria, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula fúngica, una célula de mamífero, una célula de planta, un animal transgénico o una planta transgénica.

19. Un anticuerpo o aptámero o fago que se une específicamente con la molécula de ácido nucleico mutante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 y 5 a 8, pero no con la correspondiente molécula de ácido nucleico de tipo silvestre, en el que la molécula de ácido nucleico de tipo silvestre tiene en la posición correspondiente a la posición 13910 del gen LPH una timidina y/o en la posición correspondiente a la posición -22018 una adenosina, y una molécula de ácido nucleico mutante tiene en la posición -13910 una citosina y/o en la posición correspondiente a la posición 22018 una guanina.

20. Un anticuerpo o aptámero o fago que se une específicamente con la molécula de ácido nucleico de tipo silvestre de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 y 9, pero no con la correspondiente secuencia mutante que contribuye a o es indicativa de hipolactasia de tipo adulto, en el que la molécula de ácido nucleico de tipo silvestre tiene en la posición correspondiente a la posición -13910 del gen LPH una timidina y/o en la posición correspondiente a la posición -22018 una adenosina, y una molécula de ácido nucleico mutante tiene en la posición correspondiente a la posición -13910 una citosina y/o en la posición correspondiente a la posición -22018 una guanina.

21. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico de tipo silvestre de la reivindicación 3 a 6 o el vector de la reivindicación 11, en la que la molécula de ácido nucleico de tipo silvestre tiene en la posición correspondiente a la posición -13910 del gen LPH una timidina y/o en la posición correspondiente a la posición -22018 una adenosina.

22. Una composición de diagnóstico que comprende una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el vector de la reivindicación 10 u 11, el cebador o par de cebadores de la reivindicación 12 a 15 y/o el anticuerpo, aptámero y/o fago de la reivindicación 19 o 20.

23. Un procedimiento para ensayar la presencia de o predisposición a hipolactasia de tipo adulto que comprende ensayar en una muestra obtenida de un paciente previsible o de una persona sospechosa de portar dicha predisposición la presencia de la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 y 5 a 8 en estado homocigótico o heterocigótico.

24. Un procedimiento para ensayar la presencia de o predisposición a hipolactasia de tipo adulto que comprende ensayar en una muestra obtenida de un paciente previsible o de una persona sospechosa de portar dicha predisposición la presencia de la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 y 9 en estado homocigótico o heterocigótico.

25. El procedimiento de la reivindicación 23 o 24, en el que dicho ensayo comprende hibridar la molécula de ácido nucleico complementaria de la reivindicación 8 que es complementaria de la molécula de ácido nucleico que contribuye a o es indicativa de hipolactasia de tipo adulto, o la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 9 que es complementaria de la secuencia de tipo silvestre en forma de sonda en condiciones rigurosas con moléculas de ácido nucleico comprendidas en dicha muestra y detectar dicha hibridación, en el que la molécula de ácido nucleico de tipo

silvestre tiene en la posición correspondiente a la posición -13910 del gen LPH una timidina y/o en la posición correspondiente a la posición -22018 una adenosina, y una molécula de ácido nucleico mutante tiene en la posición correspondiente a la posición -13910 una citosina y/o en la posición correspondiente a la posición -22018 una guanina.

26. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 24, que comprende adicionalmente digerir el producto de dicha hibridación con una endonucleasa de restricción o someter el producto de dicha hibridación a digestión con una endonucleasa de restricción y analizar el producto de dicha digestión.

27. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que dicha sonda está marcada detectablemente.

28. El procedimiento de la reivindicación 23 o 24, en el que dicho ensayo comprende determinar la secuencia de ácido nucleico de al menos una porción de la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo dicha porción la posición nucleotídica -13910 y/o la posición nucleotídica -22018 del gen LPH.

29. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que se efectúa la determinación de la secuencia de ácido nucleico mediante minisecuenciación en fase sólida.

30. El procedimiento de la reivindicación 28, que comprende adicionalmente, antes de determinar dicha secuencia de ácido nucleico, la amplificación de al menos dicha porción de dicha molécula de ácido nucleico.

31. El procedimiento de la reivindicación 23 o 24, en el que dicho ensayo comprende llevar a cabo una reacción de amplificación en la que al menos uno de los cebadores empleados en dicha reacción de amplificación sea el cebador de la reivindicación 12 o 13 o pertenezca al par de cebadores de las reivindicaciones 12 o 13, que comprende ensayar un producto de amplificación.

32. El procedimiento de la reivindicación 23 o 24, en el que dicho ensayo comprende llevar a cabo una reacción de amplificación en la que al menos uno de los cebadores empleados en dicha reacción de amplificación sea el cebador de la reivindicación 14 o 15 o pertenezca al par de cebadores de las reivindicaciones 14 o 15, que comprende ensayar un producto de amplificación.

33. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, en el que se efectúa dicha amplificación mediante, o dicha amplificación es, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .

34. Un procedimiento para ensayar la presencia de o predisposición a hipolactasia de tipo adulto que comprende ensayar en una muestra obtenida a partir de un ser humano la unión específica con el anticuerpo o aptámero o fago de la reivindicación 19.

35. Un procedimiento para ensayar la presencia de o predisposición a hipolactasia de tipo adulto que comprende ensayar en una muestra obtenida a partir de un ser humano la unión específica con el anticuerpo o aptámero o fago de la reivindicación 20.

36. El procedimiento de la reivindicación 34 o 35, en el que dicho anticuerpo o aptámero o fago está marcado detectablemente.

37. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, en el que el ensayo es un inmunoensayo.

38. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 37, en el que dicha muestra es sangre, suero, plasma, tejido fetal, saliva, orina, tejido mucoso, moco, tejido vaginal, tejido fetal obtenido a partir de vagina, piel, pelo, folículo piloso u otro tejido humano.

39. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 38, en el que dicha molécula de ácido nucleico de dicha muestra se fija a un soporte sólido.

40. El procedimiento de la reivindicación 39, en el que dicho soporte sólido es un chip, una oblea de silicio, una perla o una placa de microvaloración.

41. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para uso en el análisis de la presencia de o predisposición a hipolactasia de tipo adulto.

42. Kit que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el cebador o par de cebadores de las reivindicaciones 12 a 15, el vector de la reivindicación 10 u 11 y/o el anticuerpo, aptámero y/o fago de la reivindicación 19 o 20 en uno o más envases.