Gel de fibrina que contiene fibroblastos y células epiteliales del limbo esclerocorneal para bioingeniería de la superficie ocular (córnea,

conjuntiva y limbo esclerocorneal).

Un gel de fibrina autóloga que comprende fibroblastos y células epiteliales del limbo esclerocorneal (nicho de las células madres de la córnea) y un método de preparación del mismo que comprende: cultivar fibroblastos y células epiteliales del limbo esclerocorneal, resuspender los fibroblastos cultivados en una solución de plasma sanguíneo, añadir un agente antifibrinolítico a la mezcla, polimerizar la mezcla, sembrar la mezcla en un recipiente de cultivo estéril y sembrar las células epiteliales cultivadas encima de la mezcla. Este gel puede ser usado en la elaboración de medicamentos para su uso en el tratamiento de enfermedades degenerativas, inflamatorias o genéticas de la superficie ocular o, incluso, en aquellas mismas enfermedades para las que se utilizaría también esta técnica como ingeniería de tejidos.

Gel de fibrina que contiene fibroblastos y células epiteliales del limbo esclerocorneal para bioingeniería de la superficie ocular (córnea, conjuntiva y limbo esclerocorneal) .

La presente invención se encuadra en el campo de la biomedicina, la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos con células madre y se refiere a un gel de fibrina autóloga que comprende fibroblastos y células epiteliales del limbo esclerocorneal (nicho de las células madres de la córnea) . También se refiere a un método de preparación del mismo que comprende la elaboración del gel de fibrina conteniendo fibroblastos, el cual sirve de soporte para el crecimiento de las células epiteliales. Este gel, construido mediante técnicas de bioingeniería de tejidos, puede ser utilizado para la reconstrucción de la superficie ocular, tanto del limbo como de la córnea o conjuntiva, mediante su trasplante en el tejido dañado permitiendo la regeneración del mismo, o puede ser usado en la elaboración de medicamentos para su uso en el tratamiento de enfermedades degenerativas, inflamatorias o genéticas de la superficie ocular o, incluso, en aquellas mismas enfermedades para las que se utilizaría también esta técnica como ingeniería de tejidos.

Estado de la técnica anterior En los últimos años, las técnicas de ingeniería tisular han adquirido gran importancia en el desarrollo de nuevas técnicas terapéuticas para la resolución de diversos tipos de patologías. Específicamente, en el campo de la oftalmología dichas técnicas se han centrado principalmente en el desarrollo de sustitutivos biológicos que faciliten la reparación de defectos de la superficie ocular. Este es el caso de algunos de los tratamientos existentes en la actualidad frente a diversas enfermedades que afectan a la superficie corneal, como por ejemplo aquellas que se engloban en el grupo de patologías clasificadas como síndromes de insuficiencia límbica (SIL) . Uno de los tratamientos más en auge para la resolución de este grupo de patologías consiste en el trasplante de células epiteliales del limbo corneoscleral (el nicho de las células madre de la córnea) expandidas ex vivo.

Bajo condiciones fisiológicas normales, las células madre del epitelio corneal se encuentran alojadas en la región basal del epitelio limbar, en unas estructuras conocidas como empalizadas de Vogt. Dicha localización es sumamente importante para el mantenimiento no solo del fenotipo de este tipo celular sino también de sus capacidades y funciones como célula madre adulta. Es el microambiente en el que se encuentra dicha población celular el que determina su potencial como célula madre adulta. Dicho microambiente o nicho está compuesto por el resto de tipos celulares que se encuentran en la vecindad de la población de células madre del epitelio corneal, por la matriz extracelular que las rodea y, muy importante, por la lámina basal y el estroma subyacente en el que se encuentran dispersos los fibroblastos limbares. Se ha descrito que el contacto entre las regiones epitelial y estromal del limbo, así como las comunicaciones que se establecen entre los tipos celulares de ambos componentes, son esenciales para el mantenimiento de las características de las células madre del epitelio limbar.

Durante los mecanismos habituales de mantenimiento del epitelio corneal bajo condiciones normales, o bien en casos de alteraciones de la superficie corneal, la población de células madre del epitelio limbar, que normalmente se encuentra en estado quiescente, se ve inducida a sufrir procesos de división, migración y diferenciación. Es el momento en el que las células madre del epitelio limbar abandonan ese nicho cuando comienzan a diferenciarse y por tanto pierden sus características de célula madre adulta.

Por esta razón, es de vital importancia que durante la expansión ex vivo de este tipo celular se consigan reproducir, en la medida de lo posible, las condiciones microambientales en las que se encuentran en el tejido nativo. De este modo, durante los últimos años se han estudiado diferentes tipos de sustratos o soportes sobre los que expandir dicha población celular. Ejemplo de ellos son, la membrana amniótica, las capas sustentadoras de fibroblastos irradiados 3T3 (Pellegrini G., et al., 1997, The Lancet; 345: 990-993) , los geles de fibrina (Han B., et al., 2002, Cornea; 21: 505510) o la cápsula anterior del cristalino humano.

Se han construido equivalentes de la córnea humana sobre sustratos consistentes en colágeno y condroitin sulfato con glutaraldehído, basados en el desarrollo de líneas celulares a partir de células aisladas de las tres capas de la córnea, epitelio, estroma y endotelio, que son inmortalizadas por transfección vírica (May Griffith, et al., 1999, Science; 286: 2169-2172) .

Durante los mecanismos de regeneración natural tras una herida las células epiteliales migran a través de una matriz natural compuesta de fibrina y fibronectina. Además, se ha comprobado que los fibroblastos cultivados en geles de fibrina proliferan, migran y son capaces de sintetizar componentes de la matriz extracelular, como el colágeno (Tuan T., et al., 1996, Experimental Cell Research; 223: 127-134) .

Por ello, una de las aproximaciones ha sido el cultivo in vitro de las células epiteliales del limbo sobre una capa basal de fibroblastos murinos irradiados 3T3, de manera que esta construcción se puede embeber posteriormente en un gel de fibrina.

Otro sustituto biológico de la córnea se basa en geles de fibrina con agarosa, lo que requiere el cultivo de las tres capas celulares presentes en la córnea: células epiteliales, estromales y endoteliales. En este método, se siembran las células endoteliales en la base de un cultivo poroso, se desarrolla un gel de fibrina humana con agarosa conteniendo células del estroma o fibroblastos cultivados en su interior, que se sitúa sobre la capa de células endoteliales. Finalmente, las células epiteliales crecen sobre la superficie de todo este soporte. Aunque en estos estudios se ha postulado que la fibrina pura no siempre es comparable con el estroma de la córnea en cuanto a su transparencia y consistencia, por lo que se propone el uso de los geles de fibrina y agarosa en su lugar (Miguel Alaminos, et al., 2006, Investigative Ophthalmology & Visual Science; 47:8, 3311-3317) .

En otras ocasiones se han cultivado las células madre del estroma de la córnea humana en pellets, en ausencia de un soporte rígido. En este caso se ha comparado este crecimiento celular sobre pellets con el que ocurre sobre un gel de fibrina, de lo que se ha concluido que estos geles son maleables y frágiles y no permiten el depósito de una matriz densa (Yiqin Du, et al., 2007, Investigative Ophthalmology & Visual Science; 48:11, 5038-5045) .

Actualmente, las técnicas de bioingeniería tisular desarrolladas a este respecto, persiguen la búsqueda de un soporte adecuado que permita no sólo la correcta expansión de las células del epitelio limbar bajo condiciones de cultivo in vitro, sino también la posterior utilización de dicha población celular en el tratamiento de alteraciones de la superficie ocular.

Como soporte para dicha expansión celular, se precisa de un biomaterial que sea biocompatible, biodegradable y que permita la adhesión y la proliferación celular.

Generalmente, el empleo de biomateriales que actúan como soporte para el crecimiento celular con fines clínicos está asociado a una posible inducción de la respuesta inflamatoria. Además de este inconveniente, es necesario que dicho soporte sea biocompatible, y por tanto, permita la proliferación de células epiteliales del limbo esclerocorneal manteniendo las características que las definen como células madre del epitelio corneal, y por tanto, puedan cumplir con la función de reparación del tejido, lo que supone una gran complejidad, y puede desencadenar respuestas inmunológicas en el paciente trasplantado.

Descripción de la invención La presente invención proporciona un gel de fibrina que comprende fibroblastos y células epiteliales del limbo esclerocorneal. También proporciona un método de preparación del mismo que comprende la elaboración del gel de fibrina autólogo conteniendo fibroblastos, el cual sirve de soporte para el crecimiento de las células epiteliales. Este gel, construido mediante técnicas de bioingeniería de tejidos, puede ser utilizado para la reconstrucción de la superficie ocular, mediante su trasplante en el tejido dañado permitiendo la regeneración del mismo, o puede ser usado en la elaboración de medicamentos para su uso... [Seguir leyendo]

1. Gel de fibrina que comprende fibroblastos del limbo esclerocorneal.

2. Gel de fibrina según la reivindicación 1 donde los fibroblastos del limbo esclerocorneal proceden de un humano.

3. Gel de fibrina según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde los fibroblastos del limbo esclerocorneal son de origen autólogo.

4. Gel de fibrina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que, además, comprende células epiteliales del limbo esclerocorneal.

5. Gel de fibrina según la reivindicación 4 donde las células epiteliales del limbo esclerocorneal proceden de un humano.

6. Gel de fibrina según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5 donde las células epiteliales del limbo esclerocorneal son de origen autólogo.

7. Método de preparación del gel de fibrina según cualquiera de las reivindicaciones1a3que comprende:

8. Método de preparación del gel de fibrina según la reivindicación 7 donde el plasma sanguíneo del paso (b) procede de un humano.

9. Método de preparación del gel de fibrina según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 donde el plasma sanguíneo del paso (b) es de origen autólogo.

10. Método de preparación del gel de fibrina según cualquiera de las reivindicaciones7a9 donde el agente antifibrinolítico del paso (c) es ácido tranexámico.

11. Método de preparación del gel de fibrina según cualquiera de las reivindicaciones7a10donde la polimerización del paso (d) se realiza mediante la adición de CaCl2 la mezcla del paso (c) .

12. Método de preparación del gel de fibrina según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 donde el recipiente de cultivo estéril del paso (e) es una placa de cultivo.

13. Método de preparación del gel de fibrina según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 que comprende los pasos según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, y además comprende:

f. cultivar células epiteliales del limbo esclerocorneal, y

g. sembrar las células epiteliales cultivadas en el paso (f) encima de la mezcla del paso (e) .

14. Uso del gel de fibrina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 como soporte para la proliferación de células epiteliales del limbo esclerocorneal.

15. Uso del gel de fibrina según cualquiera de las reivindicaciones1a6 para la elaboración de un medicamento.

16. Uso del gel de fibrina según la reivindicación 15 para la elaboración de un medicamento para su uso en el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas, inflamatorias o genéticas de la superficie ocular.

17. Uso del gel de fibrina según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16 para la elaboración de un medicamento para su uso en el tratamiento de la ceguera corneal.

18. Uso del gel de fibrina según cualquiera de las reivindicaciones1a6 para la evaluación in vitro del comportamiento de las células epiteliales y/o fibroblastos del estroma esclerocorneal.

19. Composición farmacéutica que comprende el gel según cualquiera de las reivindicaciones1a6.

20. Composición farmacéutica según la reivindicación 19 que comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20 que comprende, además, otro principio activo.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

Nº solicitud: 200930389

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 30.06.2009

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : C12N5/071 (2010.01) A61L27/38 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

44. 449. ISSN 1932-7005 (Electrónico) . Ver todo el documento, especialmente Resumen, Introducción, Apartado 2.1 de Resultados, y tercer párrafo de Discusión. 1-6, 14-21 X ALAMINOS, M., et al. Construction of a complete rabbit cornea substitute using a fibrin-agarose scaffold. Investigative ophthalmology & visual science. Agosto 2006. Vol. 47, nº 8, página.

31. 3317. ISSN 0146-0404 (Impreso) . Ver todo el documento, especialmente cuarto apartado de Materiales y Métodos. 1-6, 14-21 Y GERMAIN, L, et al. Reconstructed human cornea produced in vitro by tissue engineering. Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology. Mayo-Junio 1999. Vol. 67, nº 3, página.

14. 147. ISSN 1015-2008 (Impreso) . Ver todo el documento. 1-21 Y US 2008/0199513 A1 (CASCADE MEDICAL ENTERPRISES, LLC) , Ver párrafos [0123] a [0127] y Ejemplo1. 1-21 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº : Fecha de realización del informe 07.04.2011 Examinador B. Pérez Esteban Página 1/6

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

Nº solicitud: 200930389

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 30.06.2009

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : C12N5/071 (2010.01) A61L27/38 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

62. 630. ISSN 0305-4179 (Impreso) . Ver todo el documento. Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº : Fecha de realización del informe 07.04.2011 Examinador B. Pérez Esteban Página 2/6

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 200930389

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C12N, A61L Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, TXTUS0, TXTUS1, TXTUS2, TXTUS3, TXTEP1, TXTGB1, TXTWO1, MEDLINE, BIOSIS, NPL, EMBASE, XPESP.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/6

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200930389

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 07.04.2011

Declaración

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 4/6

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200930389

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

44. 449. ISSN 1932-7005 (Electrónico) . D02 ALAMINOS, M., et al. Investigative ophthalmology & visual science. Agosto 2006. Vol. 47, nº 8, página.

31. 3317. ISSN 0146-0404 (Impreso) . Agosto 2006 D03 GERMAIN, L, et al. Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology. Mayo-Junio 1999. Vol. 67, nº 3, página.

14. 147. ISSN 1015-2008 (Impreso) . Mayo-Junio 1999 D04 US 2008/0199513 A1 (CASCADE MEDICAL ENTERPRISES, LLC) D05 US 2004/0137616 A1 (ISSEROFF, R.R. & SCHWAB, I.R.) D06 WO 2006/008748 A2 (PROCHON BIOTECH LTD) D07 MEANA, A., et al. Burns: journal of the International Society for Burn Injuries. Noviembre 1998. Vol. 24, nº 7, página.

62. 630. ISSN 0305-4179 (Impreso) . Noviembre 1998

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración La presente solicitud de patente describe y reivindica un gel de fibrina que contiene fibroblastos y células epiteliales del limbo esclerocorneal, así como el método de preparación del mismo y su uso para elaborar medicamentos destinados al tratamiento de enfermedades de la superficie ocular. El método de preparación del gel de fibrina consiste en resuspender fibroblastos del limbo esclerocorneal (previamente cultivados) en una solución de plasma sanguíneo, añadir un agente antifibrinolítico, polimerizar la mezcla, y sembrar sobre ella un cultivo de células epiteliales del limbo.

Hay numerosos documentos en el estado de la técnica que divulgan la preparación de tejido artificial para su utilización en regeneración de tejidos, incluyendo tejido corneal.

Los documentos D01 y D02 divulgan sustitutos artificiales de córnea (humana y de conejo, respectivamente) , preparados a partir de geles de fibrina que contienen fibroblastos del limbo, sobre los cuales se siembra un cultivo de células epiteliales corneales. Es decir, se trata de geles de fibrina como los reivindicados en la solicitud, salvo que las células empleadas en la preparación del tejido artificial en D01 y D02 son de origen heterólogo. Por tanto, el documento D01 afecta la novedad de las reivindicaciones 1, 2, 4, 5 y 14-21 de la solicitud, y la actividad inventiva de las reivindicaciones 3 y 6 (el mero hecho de emplear células de origen autólogo o heterólogo no confiere actividad inventiva a estas dos reivindicaciones) . En el caso del documento D02, al tratarse de experimentos realizados en conejo y no en humano, no afecta la novedad, pero sí la actividad inventiva de las reivindicaciones 1-6 y 14-21 de la presente solicitud.

Por lo tanto, las reivindicaciones 1, 2, 4, 5 y 14-21 de la solicitud no cumplen el requisito de novedad del artículo 6.1 de la Ley 11/1986 de Patentes, y las reivindicaciones 1-6 y 14-21 no cumplen el requisito de actividad inventiva del artículo 8.1 de la mencionada Ley de Patentes.

El documento D03 consiste en un estudio para reconstruir córnea humana in vitro por ingeniería de tejidos. Para ello, cultivan fibroblastos del limbo corneal en geles de colágeno, y, tras 4 días, siembran en ese gel células epiteliales de la córnea (ver, por ejemplo, primer apartado de Resultados) . Por tanto, los experimentos descritos en el documento D03 son los mismos que los de la solicitud de patente, excepto por la matriz utilizada para la construcción del tejido, que es fibrina en un caso y colágeno en el otro. Es conocido en el campo técnico de cultivo de tejidos que hay una gran variedad de matrices empleadas para regeneración tisular. Así, por ejemplo, en el documento D04 se describen métodos de preparación de geles de fibrina para su uso en regeneración tisular. En los párrafos [0123] a [0127] y en el ejemplo 1 de este documento, se describe la preparación de geles de fibrina a partir de plasma sanguíneo al que se añade ácido tranexámico y cloruro cálcico, que es el método de las reivindicaciones 7 a 12 de la solicitud de patente.

Por lo tanto, resultaría obvio para el experto en la materia la combinación de la información divulgada en los documentos D03 y D04 para preparar el gel reivindicado en la solicitud, por lo que ésta no cumple el requisito de actividad inventiva según el artículo 8.1 de la Ley de Patentes.

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OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200930389

También el documento D05 describe un implante para el tratamiento de la superficie epitelial de córneas dañadas o enfermas. La preparación del implante comprende el cultivo de fibroblastos del estroma corneal sobre una matriz extracelular sobre la que se siembran posteriormente células epiteliales corneales. Una de las matrices empleadas en D05 es un gel de fibrina. En el ejemplo 5 de este documento se detalla el procedimiento de formación del gel, que coincide con el de la solicitud de patente, salvo en el hecho de que en D05 emplean aprotinina en lugar de ácido tranexámico, que es el agente utilizado en la solicitud. El empleo de ambos agentes fibrinolíticos es ampliamente conocido en el estado de la técnica, como se puede ver, por ejemplo, en el documento D06, en el que se enumeran varios agentes antifibrinolíticos, incluyendo aprotinina y ácido tranexámico (ver página 29, líneas 4 y 5) . El experto en la materia no necesitaría realizar ningún esfuerzo inventivo para preparar el gel de fibrina de la solicitud a la luz de lo divulgado en los documentos D05 y D06. Por lo tanto, estos dos documentos afectan la actividad inventiva de la presente solicitud, que no cumpliría el requisito del artículo 8.1 de la Ley de Patentes.

El documento D07 divulga un método de generación de tejido artificial muy semejante al de la solicitud de patente, pues consiste en el cultivo de fibroblastos sobre un gel de fibrina y la posterior siembra de células epiteliales sobre el gel. Dado que en el documento D07 se utilizan células de la epidermis y se genera piel humana, no se considera que este documento afecte la novedad ni la actividad inventiva de la solicitud.

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