Una formulación para uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante una terapia,

cuya formulación comprende: un polinucleótido complementario de una conexina humana;

junto con un soporte o un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

Formulaciones que comprenden nucle6tidos antisentidos para conexinas Este invento se refiere a las formulaciones para usar en tratamientos terapeuticos y/o cosmeticos, particularmente aquellos en los que una interrupción localizada en la comunicación directa celula-celula es deseable. 5 ANTECEDENTES Las uniones intercelulares son estructuras de membrana celular que facilitan la comunicación directa celula-celula. Un canal de unión intercelular esta formado por dos hemicanales (conexones) , cada uno esta compuesto por seis subunidades de conexinas. Estas conexinas son una familia de proteinas, comunmente denominadas segun sus pesos moleculares o clasificadas segun una base filogenetica, es decir, en una clase α y una clase β. 10 Una capacidad para controlar la expresión de las conexinas (y en particular para disminuir sus niveles) proporcionaria por lo tanto una oportunidad para modular la comunicación celula-celula en un paciente, para propósitos terapeuticos y/o de remedio. Sin embargo, ya que un numero de proteinas conexinas se expresa ampliamente a traves del cuerpo, no se desea un efecto de disminución general de los niveles para inducir un efecto terapeutico en un sitio especifico. 15 Los oligonucle6tidos antisentidos (ODNs) tienen un potencial considerable como agentes para la manipulación de la expresión genica especifica (revisado: Stein y otros, 1992; Wagner 1994) . Sin embargo, quedan dificultades que necesitar ser superadas. Estas incluyen la vida media corta de tales ODNs (olig6meros fosfodiester sin modificar tienen tipicamente una vida media intracelular de sólo 20 minutos debido a la degradación por nucleasas intracelulares (Wagner 1994) ) y su liberación de modo consistente y fiable a los tejidos diana.

Fue con la intención de superar al menos parcialmente estas dificultades que los solicitantes concibieron el presente invento. RESUMEN DEL INVENTO La invención se define en las reivindicaciones. Consecuentemente, en un primer aspecto, el invento proporciona una formulación para uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante una terapia, cuya formulación 25 comprende: un polinucle6tido complementario de una conexina humana; junto con un soporte o un vehiculo farmaceuticamente aceptable. En una forma preferida, la formulación contiene polinucle6tidos sólo para una proteina conexina. Mas preferiblemente, la proteina conexina es conexina 43.

Muchos aspectos del invento se describen con referencia a los oligodesoxinucle6tidos. Sin embargo, se comprende que otros polinucle6tidos adecuados (tales como polinucle6tidos ARN) pueden ser usados en estos aspectos. Alternativamente, la formulación contiene oligodesoxinucle6tidos para mas de una proteina conexina. Preferiblemente, una de las proteinas conexinas a la que se dirigen los oligodesoxinucle6tidos es conexina 43. Otras proteinas conexinas a las que los oligodesoxinucle6tidos estan dirigidos incluyen conexina 26, conexina 31.1 y conexina 32.

Convenientemente se selecciona el oligodesoxinucle6tido para conexina 43 de: GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC, GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC, y GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT Lo mas convenientemente el oligodesoxinucle6tido para la conexina 43 es:

GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC Convenientemente el oligodesoxinucle6tido para la conexina 26 y es: TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA Convenientemente el oligodesoxinucle6tido para la conexina 31.1 es: CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C

45 Convenientemente el oligodesoxinucle6tido para la conexina 32 es:

TTT CTT TTC TAT GTG CTG TTG GTG A.

Los polinucle6tidos antisentido se pueden formular para administración parenteral, intramuscular, intracerebral, intravenosa, subcutanea o transdermica. Los polinucle6tidos antisentido se administran preferentemente de forma t6pica (en la parte a ser tratada) . Adecuadamente, los polinucle6tidos antisentido se combinan con un excipiente, vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptables para proporcionar una composición farmaceutica.

Excipientes o vehiculos farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen cualquiera de los comunmente usados para administración t6pica. La formulación t6pica puede estar en forma de crema, unguento, gel, emulsión, loción o pintura. La formulación del invento se puede presentar tambien en forma de un apósito impregnado.

Materiales excipiente adecuados incluyen cualquier excipiente o vehiculo comunmente usado como base para cremas, lociones, geles, emulsiones, lociones o pinturas para la administración t6pica. Los ejemplos incluyen agentes de emulsificación, excipientes inertes que incluyen bases hidrocarbonadas, bases de emulsificación, disolventes no t6xicos o bases hidrosolubles. Ejemplos particularmente adecuados incluyen lanolina, parafina dura, parafina liquida, parafina amarilla blanda o parafina blanca blanda, cera de abeja blanca, cera de abeja amarilla, cetoestearil alcohol, cetilalcohol, dimeticonas, ceras emulsionantes, isopropil miristato, cera microcristalina, alcohol oleilico y alcohol estearilico.

Preferentemente, el excipiente farmaceuticamente aceptable o vehiculo es un gel, un gel copolimero polioxietilenopolioxipropileno no iónico adecuado, por ejemplo, un gel Plur6nico, preferentemente Plur6nico F-127 (BASF Corp.) . Este gel es particularmente preferido, ya que es liquido a baja temperatura pero rapidamente se fija a temperaturas fisiológicas, que limitan la liberación del componente ODN al sitio de aplicación o inmediatamente adyacente a ese sitio.

Un agente auxiliar tal como caseina, gelatina, albumina, pegamento, alginato s6dico, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa o polivinil alcohol se pueden incluir tambien en la formulación del invento.

La composición farmaceutica se puede formular para proporcionar una liberación sostenida del polinucle6tido antisentido.

Convenientemente, la formulación incluye ademas un tensioactivo para ayudar con la penetración oligodesoxinucleotidica a la celula o la formulación puede contener cualquier agente de carga adecuado. Cualquier tensioactivo no t6xico adecuado puede ser incluido, tal como DMSO. Alternativamente, se puede incluir un agente de penetración transdermica tal como la urea.

En la presente memoria tambien se describe un metodo de reducción, de sitio especifico, de los niveles de expresión de la proteina conexina con fines terapeuticos y/o cosmeticos, que comprende administrar una formulación como se define anteriormente a un sitio o en un paciente en el se requiere dicha reducción.

Todavia en otro aspecto, se describe un metodo para reducir la muerte celular neuronal que de otra manera resultaria de una lesión neuronal en un sitio especifico del cerebro, medula espinal o nervio óptico de un paciente, que comprende la etapa de administrar una formulación como se define anteriormente a dicho sitio para reducir la expresión de proteina (s) conexina (s) en un sitio inmediatamente adyacente a dicho sitio.

Preferiblemente, la formulación se administra para reducir la perdida neuronal debida a trauma fisico del cerebro, medula espinal o nervio óptico.

Convenientemente, la formulación se administra en una cantidad suficiente para reducir los niveles de expresión de dicha (s) proteina (s) conexina (s) durante al menos 24 horas despues de la administración.

Todavia en otro aspecto adicional, la invención proporciona un medio para estimular la cicatrización de heridas en un paciente, que comprende la etapa de administrar una formulación como se define anteriormente a dicha herida para reducir el nivel de expresión de una (s) proteina (s) conexina (s) en un sitio inmediatamente adyacente a dicha herida.

Generalmente, la herida sera el resultado de un trauma, incluyendo quemaduras. Puede ser, sin embargo, el resultado de una operación.

Tambien se describe un metodo para reducir la inflamación como parte del tratamiento de una herida y/o tejido sometido a trauma fisico que comprende la etapa de administrar una formulación como se define anteriormente o pr6xima a dicha herida o tejido.

Preferentemente, dicha herida es una quemadura.

Alternativamente, dicha herida es el resultado de un trauma fisico en el tejido, incluyendo tejidos neuronales como el cerebro, la medula espinal o el nervio óptico.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona un medio para disminuir la formación de cicatrices en un paciente que ha padecido... [Seguir leyendo]

1.Una formulación para uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante una terapia, cuya formulación comprende: un polinucle6tido complementario de una conexina humana; junto con un soporte o un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

2.Una formulación para uso en el tratamiento de una lesión tisular, cuya formulación comprende:

un polinucle6tido complementario de una conexina; junto con un soporte o un vehiculo farmaceuticamente aceptable. 3.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que se formula para administración t6pica. 4.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 3, que esta en forma de una crema, una pomada, un gel, una emulsión, una loción o una pintura. 5.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 4, que esta en forma de un gel. 6.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 5, que esta en forma de un gel de copolimero no iónico polioxietileno-polioxipropileno. 7.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 5, que esta en forma de un gel de Pluronic. 8.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende Pluronic F-127. 9.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende 30% de Pluronic F-127. 10.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el polinucle6tido se formula para la administración por via parenteral, intramuscular, intracerebral, subcutanea o transdermica.

11.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es una formulación de liberación retardada. 12.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente un agente auxiliar seleccionado entre caseina, gelatina, albumina, pegamento, alginato s6dico, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa o alcohol polivinilico. 13.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente uno o varios entre un agente tensioactivo, un emulsionante, un agente de carga, un vehiculo inerte y un agente de penetración transdermica.

14.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que esta en forma de vendaje impregnado por lo menos con un polinucle6tido complementario de una conexina. 15.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polinucle6tido es ADN.

16.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el polinucle6tido es ARN. 17.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde el polinucle6tido es un oligodesoxinucle6tido.

18.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el oligodesoxinucle6tido es un oligonucle6tido de fosfodiester no modificado. 19.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde el polinucle6tido es un oligonucle6tido modificado quimicamente seleccionado entre fosforotioatos, metilfosfonatos, fosforamidatos, fosforoditioatos, N3'P5'-fosforamidatos, fosforotioatos de oligorribonucle6tido y sus analogo.

2. Oalquilicos, metilfosfonatos d.

2. O-metilribonucle6tido y oligonucle6tidos con la cadena principal hibrida.

20.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polinucle6tido tiene una longitud comprendida entre 6 y 40 nucle6tidos. 21.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polinucle6tido tiene una longitud comprendida entre 12 y 20 nucle6tidos.

22.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde el polinucle6tido tiene una longitud de al menos 40 nucle6tidos.

23.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que contiene polinucle6tidos complementarios de una conexina a.

24.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, que contiene polinucle6tidos complementarios de una conexina .

25.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la conexina es conexina 26, conexina 31.1, conexina 32, conexina 36 o conexina 43.

26.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 y 25, en donde la conexina es conexina 43.

27.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, 24 y 25, en donde la conexina es conexina 31.1.

28.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, 24 y 25, en donde la conexina es conexina 26.

29.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que contiene polinucle6tidos complementarios de mas de una conexina.

30.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 29, que incluye polinucle6tidos complementarios de conexina 26, conexina 31.1, conexina 32, conexina 36, conexina 40, conexina 43 y/o conexina 45.

31.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, que contiene polinucle6tidos complementarios de una sola conexina.

32.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31, en la que el polinucle6tido complementario de la conexina 43 se selecciona entre:

el polinucle6tido complementario de la conexina 26 es:

el polinucle6tido complementario de la conexina 31.1 es:

o el polinucle6tido complementario de la conexina 32 es:

33.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 32, en donde el polinucle6tido complementario de la conexina 43 es GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC.

34.Una formulación para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25, 26 y 29 a 31, en la que el polinucle6tido complementario presenta una homologia de al menos 70% con un polinucle6tido que tiene la siguiente secuencia:

35.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 34, en la que el polinucle6tido complementario tiene una homologia de al menos 90% con un polinucle6tido que tiene la siguiente secuencia:

36.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 35, en donde el polinucle6tido complementario tiene una homologia de al menos 95% con la siguiente secuencia:

37.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, en donde el polinucle6tido complementario es bicatenario.

38.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, en donde el polinucle6tido complementario es monocatenario.

39.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polinucle6tido complementario es capaz de unirse a un ARNm de conexina.

40.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 39, en donde el polinucle6tido complementario es capaz de unirse a un ARNm de la conexina 43.

41.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 39 o 40, en donde el polinucle6tido complementario tiene una complementariedad absoluta con el ARNm.

42.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 39 o 40, en donde el polinucle6tido complementario no tiene una complementariedad absoluta con el ARNm.

43.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 42, en donde el polinucle6tido complementario se puede unir a un ARNm de conexina (i) en 5' de la secuencia codificante, y/o (ii) en la secuencia codificante y/o (iii) en 3' de la secuencia codificante.

44.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 42, en donde el ARN comprende la SEº ID NO: 12.

45.Una formulación para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se formula en una cantidad suficiente para disminuir la muerte celular en una herida en un tejido de mamifero, o inmediatamente adyacente a la misma.

46.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 45, en donde el tejido de mamifero se selecciona entre la piel, el tejido neural, el cerebro, la medula espinal, el tejido conjuntivo y los vasos sanguineos.

47.Una formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para uso en un metodo para favorecer la cicatrización de heridas.

48.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 47, en donde la conexina es conexina 43, conexina 31.1 o conexina 26.

49.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 47 o 48, en donde la formulación es una formulación de liberación retardada.

50.Una formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, para uso en el tratamiento de una herida, en donde la formulación se aplica antes de restanar o cerrar una herida.

51.Una formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, para uso en un metodo de tratamiento de una herida producida por cirugia.

52.Una formulación para uso de acuerdo con la reivindicación 51, en donde la formulación se aplica antes de cerrar una herida quirurgica.

53.Una formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, para uso en un metodo para favorecer el rejuvenecimiento o el engrosamiento de la piel con un fin terapeutico mediante la regulación de la división y del crecimiento de las celulas basales epiteliales, en donde la conexina es la conexina 26 o la conexina 43.

54.Una formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, para uso en un metodo para favorecer el rejuvenecimiento o el engrosamiento de la piel con un fin terapeutico mediante la regulación de la queratinización de la capa externa, en donde la formulación contiene un polinucle6tido complementario de la conexina 31.1.

55.Una formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, para uso en un metodo para:

(a) reducir la muerte de celulas neuronales que de otro modo seria el resultado de una lesión neuronal;

(b) tratar un dano neuronal en el cerebro, la medula espinal o el nervio óptico, o lesiones cerebrales;

(c) tratar lesiones de la medula espinal o un traumatismo de la medula espinal;

(d) tratar trastornos neurodegenerativos;

(e) favorecer la cicatrización de una herida que se ha originado por traumatismo, quemaduras o cirugia;

(f) reducir la inflamación;

(g) tratar una apoplejia isquemica;

(h) disminuir la formación de cicatrices; o

(i) rejuvenecer la piel con un fin terapeutico.

56.Una formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, para uso en un metodo para el tratamiento de una apoplejia isquemica, en donde la formulación comprende un polinucle6tido complementario de una proteina conexina 43.

57.Un producto para almacenar o suministrar una formulación, que comprende un polinucle6tido complementario de una proteina conexina, comprendiendo dicho producto una jeringa y una aguja, en donde el producto contiene un polinucle6tido complementario de una proteina conexina y un gel de Pluronic F-127.

58.Un producto de acuerdo con la reivindicación 57, en donde la proteina conexina es conexina 43.

59.El uso de una formulación tal y como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, en la fabricación de un medicamento para:

(a) favorecer la cicatrización de una herida;

(b) reducir la muerte de celulas neuronales que de otro modo seria el resultado de una lesión neuronal;

(c) tratar un dano neuronal en el cerebro, la medula espinal o el nervio óptico, o lesiones cerebrales;

(d) tratar lesiones de la medula espinal o un traumatismo de la medula espinal;

(e) tratar trastornos neurodegenerativos;

(f) reducir la inflamación;

(g) tratar una apoplejia isquemica;

(h) disminuir la formación de cicatrices; o

(i) rejuvenecer la piel con un fin terapeutico.

60.Un uso de acuerdo con la reivindicación 59, en donde la herida es el resultado de un traumatismo, quemaduras o cirugia. 61.Un polinucle6tido complementario de una conexina, en donde:

(a) la conexina es la conexina 43 y el polinucle6tido se selecciona entre:

(b) la conexina es la conexina 26 y el polinucle6tido es

(c) la conexina es la conexina 31.1 y el polinucle6tido es

(d) la conexina es la conexina 32 y el polinucle6tido es

62.Un polinucle6tido complementario de acuerdo con la reivindicación 61, que es ADN. 63.Un polinucle6tido complementario de acuerdo con la reivindicación 61, que es ARN.

64.Un polinucle6tido complementario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 61 a 63, que es un oligodesoxinucle6tido.

65.Un polinucle6tido complementario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 61 a 64, que es bicatenario.

66.Un polinucle6tido complementario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 61 a 64, que es monocatenario.

67.Un polinucle6tido complementario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 61 a 66, que es un oligonucle6tido modificado quimicamente, seleccionado entre fosforotioatos, metilfosfonatos, fosforamidatos, fosforoditioatos, N3'P5'-fosforamidatos, fosforotioatos de oligorribonucle6tido y sus analogo.

2. O-alquilicos, metilfosfonatos d.

2. O-metilribonucle6tido y oligonucle6tidos con la cadena principal hibrida.

FIGURAºAA

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