Una proteína FVIII con actividad procoagulante que incluye un polipéptido FVIII modificado cuya modificación comprende la sustitución o deleción de al menos un aminoácido seleccionado del grupo formado por asparagina 239,

asparagina 2118, serina 241 y treonina 2120, comprendiendo dicha modificación preferentemente al menos

- la sustitución de la asparagina 239 por un aminoácido seleccionado del grupo formado por alanina, glicina, serina, glutamina, treonina, ácido aspártico o ácido glutámico y preferentemente por alanina o glutamina;

- la sustitución de la asparagina 2118 por un aminoácido seleccionado del grupo formado por alanina, serina, glutamina, treonina, ácido aspártico o ácido glutámico y preferentemente por alanina o glutamina;

- la sustitución de la asparagina 239 y la asparagina 2118 por alanina o glutamina;

- la sustitución de la asparagina 239 por alanina y la asparagina 2118 por glutamina

- la sustitución de la asparagina 239 por glutamina y la asparagina 2118 por alanina

Factor VIII recombinante demanosilado para el tratamiento de pacientes con hemofilia A.

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un Factor VIII modificado sustancialmente no inmunogénico o menos inmunogénico. La invención se refiere además a las construcciones de ácido nucleico, incluyendo el ADN que codifica el FVIII modificado, y a los procedimientos para la expresión y producción del FVIII modificado en una célula huésped o en un organismo. La invención también se refiere a los procedimientos de administración del FVIII modificado a un sujeto para tratar una alteración hemorrágica.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El factor humano VIII:C (FVIII) es el factor de coagulación deficiente en el trastorno hemorrágico de la hemofilia A ligado el cromosoma X, siendo la hemofilia una fuente importante de morbilidad hemorrágica y mortalidad en los hombres afectados. Tradicionalmente, los hemofílicos recibían transfusiones de toda la sangre. Más recientemente, el tratamiento ha consistido en preparaciones de concentrados de FVIII derivados de plasma humano. Sin embargo, el consumo de productos derivados de plasma expone a los pacientes hemofílicos a un posible riesgo de contraer enfermedades transmitidas por virus, como hepatitis y sida. Los costosos esquemas de purificación para reducir el riesgo aumentan los costes del tratamiento. Con el aumento de costes y la limitada disponibilidad de FVIII derivado de plasma, los pacientes reciben el tratamiento esporádicamente en base a la demanda más que en su profilaxis. El FVIII producido en forma recombinante tiene ventajas importantes con respecto al FVIII derivado del plasma en lo que respecta a su pureza y seguridad así como también por el aumento de su disponibilidad. Por consiguiente, se han hecho muchos esfuerzos por desarrollar el FVIII producido en forma recombinante. Debido a la naturaleza lábil del FVIII, especialmente después de su activación, se deben administrar grandes y repetidas dosis de proteínas derivadas del plasma o en forma recombinante para obtener un beneficio terapéutico. Sin embargo, la cantidad de proteína del FVIII a la que el paciente está expuesto se ha relacionado con el desarrollo de anticuerpos que inhiben su actividad. En virtud de esta conocida inmunogenicidad, uno de los objetivos al desarrollar nuevas formas recombinantes del FVIII para su uso como agente terapéutico es el desarrollo de productos que reducen o eliminan dicha respuesta inmunitaria. Las funciones del FVIII en la vía intrínseca de la coagulación de la sangre como cofactor para acelerar la activación del factor X mediante el factor IXa, una reacción que ocurre en una superficie fosfolipídica cargada negativamente ante la presencia de iones calcio.

La molécula del FVIII se divide en 6 dominios estructurales: un dominio A triplicado (A1, A2, A3) , un dominio central rico en carbohidratos y prescindible (dominio B) y un dominio C duplicado (C1, C2) (consulte la figura 5) . El FVIII es secretado al plasma como un heterodímero de una cadena pesada (dominios A1-A2-B) y una cadena ligera (dominios A3-C1-C3) asociados mediante un ligamiento no covalente de iones metálicos divalentes entre los dominios A1 y A3. En el plasma, el FVIII se estabiliza uniéndose al factor de von Willebrand. Más específicamente, la cadena ligera de FVIII se una mediante interacciones no covalentes a un centro de unión primario en el terminal amino del factor de von Willebrand. En la activación proteolítica mediante trombina, el FVIII se activa a un heterotrímero de 2 fragmentos de la cadena pesada (A1, un fragmento de 50 kDa y A2, un fragmento de 43 kDa) y de la cadena ligera (A3-C1-C2, una cadena de 73 kDa) . La forma activa del FVIII (FVIIIa) , por lo tanto, consiste en una subunidad de A1 asociada a través del ligamiento de iones metálicos divalentes a una cadena ligera de A3-C1-C2 escindida a la trombina y una subunidad no unida a A2 asociada con el dominio A1 a través de una asociación de iones. Este heterotrímero de FVIIIa es inestable y está sujeto a una rápida inactivación a través de la disociación de la subunidad A2 en condiciones fisiológicas. La molécula de FVIII contiene 25 secuencias de consenso (Asn-Xxx-Thr/Ser) que permiten la glicosilación ligada a N, 20 de las cuales han demostrado ser glicosiladas (1) .

La proteína del FVIII puede estar definida desde el punto de vista funcional como un factor capaz de complementar el defecto de coagulación en el plasma de los pacientes afectados con hemofilia A. Para permitir el tratamiento de la hemofilia A, el FVIII ha sido purificado a partir de plasma humano o porcino y, más recientemente, producido mediante tecnologías de ADN recombinante. El documento EE. UU. 4.965.199 describe, por ejemplo, procedimientos desarrollados para la producción recombinante de cantidades terapéuticas de FVIII en células huésped de mamíferos. Asimismo, se ha informado la expresión humana del FVIII en células de ovario de hámster chino (CHO) y células de riñón de hámster bebé (BHKC) y, más recientemente, también se ha demostrado la eficacia del FVIII con el dominio B eliminado en ensayos clínicos (documento EE. UU. 4.868.112, ref. 2) .

El documento US 2005/0100990 reivindica mutantes del factor VIII modificado en los que los sitios de N-glicosilación se encuentran alterados por la sustitución de un aminoácido de una secuencia consenso de glicosilación por otro aminoácido o por la deleción de todo o parte del dominio B, lo cual da como resultado la pérdida de varios sitios de Nglicosilación. Sin embargo, ninguno de los mutantes concretos descritos en este documento se corresponde realmente con la deleción o la sustitución de ninguno de los aminoácidos asparagina 239, asparagina 2118, serina 241 o treonina La publicación "Bioengineering of coagulation factor VIII for improved secretion" Miao Hongzhi, Blood, vol. 103 nº 9, 2004, se centra en un FVIII modificado cuya secreción se encuentra mejorada en particular por la deleción del dominio

B. La variante del FVIII incluye 226 aminoácidos del dominio B, en el que las Asn están sustituidas por Gln en la secuencia consenso de N-glicosilación en las posiciones 757, 784, 828, 900 y 963.

El documento US 6.759.216 reivindica moléculas modificadas del FVIII que muestran una menor inmunogenicidad y más concretamente un FVIII humano con deleción del dominio B en el que se ha incorporado un sitio de N-glicosilación en las posiciones 486-488 del dominio A2.

La publicación "The B domain of coagulation factor VIII interacts with the asialoglycoprotein receptor", Bovenschen et al., JTH Jun 2005, vol. 3, nº 6, 2005 estudia la interacción del FVIII con el receptor lectina endocítico de asialoglicoproteínas (ASGPR) . Este documento reivindica en particular que el ensamblaje del complejo FVIII-ASGPR está dirigido por elementos estructurales dentro del dominio B del FVIII y que la deglicosilación total de la cadena pesada del FVIII por la endoglicosidasa F anula completamente la interacción con el ASGPR.

Los productos terapéuticos del FVIII disponibles comercialmente incluyen el FVIII derivado del plasma (pdFVIII) y los productos del FVIII recombinante (rFVIII) como el rFVIII completo (Kogenate® Bayer, Advate® Baxter, Helixate® CSL- Behring) y un rFVIII con el dominio B eliminado (Refacto® Wyeth) .

Sin embargo, a pesar de la disponibilidad del FVIII de calidad terapéutica, la necesidad de análogos del FVIII con propiedades mejoradas sigue siendo alta. Es más, el tratamiento de pacientes con hemofilia A con FVIII terapéutico (pdFVIII o rFVIII) provoca, en 15 al 30% de los casos, la aparición de anticuerpos anti FVIII (inhibidores) que neutralizan la actividad procoagulante del FVIII administrado terapéuticamente (3, 4) . La aparición de inhibidores se considera un reflejo de la respuesta inmunitaria alogénica a la administración repetida de una proteína del FVIII exógeno. Algunos hemofílicos son muy sensibles al factor VIII recombinante exógeno y desarrollan anticuerpos anti factor VIII limitando la eficacia del tratamiento. Por lo tanto, el desarrollo de inhibidores del FVIII representa un gran obstáculo médico y un asunto de preocupación crítico ya que los pacientes que producen los inhibidores del FVIII se vuelven resistentes a la terapia de sustitución habitual. La aparición de inhibidores del FVIII no sólo provoca un aumento 3 veces mayor de los costes del tratamiento (5) sino que también afecta drásticamente la calidad de vida de los pacientes, aumentando la morbilidad y la mortalidad. En este sentido, se espera proporcionar un FVIII con reducción o ausencia del potencial para inducir... [Seguir leyendo]

1. Una proteína FVIII con actividad procoagulante que incluye un polipéptido FVIII modificado cuya modificación comprende la sustitución o deleción de al menos un aminoácido seleccionado del grupo formado por asparagina 239, asparagina 2118, serina 241 y treonina 2120, comprendiendo dicha modificación preferentemente al menos

º la sustitución de la asparagina 239 por un aminoácido seleccionado del grupo formado por alanina, glicina, serina, glutamina, treonina, ácido aspártico o ácido glutámico y preferentemente por alanina o glutamina;

º la sustitución de la asparagina 2118 por un aminoácido seleccionado del grupo formado por alanina, serina, glutamina, treonina, ácido aspártico o ácido glutámico y preferentemente por alanina o glutamina;

º la sustitución de la asparagina 239 y la asparagina 2118 por alanina o glutamina;

º la sustitución de la asparagina 239 por alanina y la asparagina 2118 por glutamina

º la sustitución de la asparagina 239 por glutamina y la asparagina 2118 por alanina

2. Una proteína FVIII según la reivindicación 1, en la que la modificación de dicho polipéptido FVIII modificado incluye además la deleción de todo o parte del dominio B descrito en SEQ ID Nº : 10

3. Una proteína FVIII según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el polipéptido FVIII modificado incluye al menos una de ambas:

(i) la secuencia de ácidos nucleicos descrita en SEQ ID Nº : 6; y/o

(ii) la secuencia de ácidos nucleicos descrita en SEQ ID Nº : 8

4. Una molécula aislada de ácidos nucleicos o una secuencia aislada modificada de ácidos nucleicos que codifica la proteína FVIII de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en que dicha secuencia de ácidos nucleicos o secuencia modificada de ácidos nucleicos que codifica dicho polipéptido FVIII modificado incluye al menos una de las siguientes:

(i) la secuencia de ácidos nucleicos descrita en SEQ ID Nº : 5; y/o

(ii) la secuencia de ácidos nucleicos descrita en SEQ ID Nº : 7

5. La molécula de ácidos nucleicos complementaria de la molécula de ácidos nucleicos aislada de la reivindicación 4.

6. Un vector de expresión que incluye una molécula aislada de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5.

7. Una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6 o que expresa la proteína FVIII de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. Un organismo transgénico no humano que expresa la proteína FVIII de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, siendo seleccionado preferiblemente dicho organismo entre un microorganismo, un animal, un mamífero o una planta.

9. Una composición que incluye una proteína FVIII según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, preferiblemente una composición farmacéutica o liofilizada y más preferiblemente que incluya un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Un método para la producción de una proteína FVIII según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que incluye los pasos de:

a) Hacer crecer en un cultivo una célula hospedadora transformada o transfectada con la molécula de ácidos nucleicos de la reivindicación 4 ó 5, o con una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína FVIII como la de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y b) aislar de la célula hospedadora y/o del medio de cultivo la proteína FVIII resultante de la expresión de la molécula de ácidos nucleicos.

11. La proteína FVIII según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por una deficiencia de FVIII, siendo dicha enfermedad preferentemente hemofilia A o hemofilia adquirida.

12. El uso de una proteína FVIII según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de un medicamento para tratar hemofilia A o hemofilia adquirida.