Un método de expansión de una población de células madre hematopoyéticas CD34+ ex vivo,

mientras almismo tiempo, se inhibe la diferenciación de dichas células madre ex vivo, comprendiendo el método:

a) cultivar dichas células madre ex vivo CD34+ bajo condiciones que permiten laproliferación celular, comprendiendo dichas condiciones las que proporcionan nutrientes, suero yuna combinación de citoquinas incluyendo factor de células madre, trombopoyetina, ligando FLt3, IL-6 e IL-3, y

b) en el mismo medio de cultivo añadir nicotinamida en una cantidad de entre 1,0 mM a 10mM,

en el que dichas células son cultivadas durante un período de cultivo que da como resultado la expansión de lapoblación de células madre hematopoyéticas CD34+ mientras se inhibe la diferenciación de dichas células madrehematopoyéticas CD34+ ex vivo, para producir una población expandida de células madre hematopoyéticas CD34+con una mayor proporción de células CD34+/Lin- y CD34+/CD38- en el cultivo expandido, en comparación con lascélulas CD34+ cultivadas en presencia de citoquinas y nutrientes, sin nicotinamida añadida exógenamente.

CAMPO .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a métodos de expansión de células madre renovables, a poblaciones expandidas de células madre renovables y a sus usos. En particular, la presente invención se refiere a métodos para reducir la expresión y/o actividad de CD38. La expansión de células madre ex vivo y/o in vivo se consigue mediante la regulación negativa de la señalización del receptor de ácido retinoico (RAR) , el receptor de retinoides X (RXR) , y/o el receptor de la Vitamina D (VDR) , a nivel de proteínas mediante antagonistas de RAR, RXR y/o VDR o a nivel de la expresión mediante técnicas de ingeniería genética, tales como técnicas de ARN interferente pequeño (ARNip) . La expansión ex vivo y/o in vivo de células madre se consigue mediante la regulación negativa de CD38 a nivel de proteínas mediante inhibidores de CD38, tales como, por ejemplo, nicotinamida, o a nivel de la expresión mediante técnicas de ingeniería genética, tales como técnicas de ARN interferente pequeño (ARNip) . La presente invención se refiere además a aplicaciones terapéuticas en las que se utilizan estos métodos y/o las poblaciones de células madre expandidas obtenidas de este modo.

Ha surgido una necesidad cada vez mayor de cultivos ex vivo de células madre hematopoyéticas y no hematopoyéticas, en particular para fines tales como expansión de células madre y transducción génica mediada por retrovirus. Los métodos para generar cultivos ex vivo de células madre hasta la fecha, sin embargo, dan como resultado un rápido declive de la actividad de la población de células madre, que da como resultado además un potencial de auto-renovación marcadamente alterado y una reducida transplantabilidad de las poblaciones de células cultivadas. La necesidad de mejorar dichos métodos es obvia. Adicionalmente, las aplicaciones en terapia génica que usan vectores retrovirales necesitan el uso de células madre hematopoyéticas proliferantes, aunque requieren que estas células permanezcan indiferenciadas mientras están en cultivo, para mantener la expresión a largo plazo del gen transducido. Por lo tanto, la capacidad de mantener cultivos ex vivo de poblaciones de células madre hematopoyéticas y no hematopoyéticas con capacidad de auto-renovación a largo plazo es de importancia crítica para una amplia serie de aplicaciones médicas y terapéuticas.

Actualmente, la expansión de células madre renovables se ha conseguido cultivando las células madre sobre una capa nutritiva de fibroblastos, o cultivando las células en presencia de las citoquinas de acción temprana trombopoyetina (TPO) , interleuquina-6 (IL-6) , un ligando de FLT-3 y el factor de células madre (SCF) (Madlambayan GJ et al (2001) J Hematother Stem Cell Res 10: 481, Punzel M et al (1999) Leukemia 13: 92, y Lange W et al (1996) Leukemia 10: 943) . Mientras que la expansión de células madre sobre una capa nutritiva da como resultado una amplia, sustancialmente sin fin expansión celular, la expansión de las células madre sin una capa nutritiva, en presencia de las citoquinas de acción temprana, da como resultado un elevado grado de diferenciación (véase los controles descritos en la sección de Ejemplos y Leslie NR et al (Blood (1998) 92: 4798) , Petzer AL et al (1996) J Exp Med Jun 183: 2551, Kawa Y et al (2000) Pigment Cell Res 8: 73) .

En cualquier caso, usando tecnología actual, las células madre no pueden expandirse a menos que en primer lugar se enriquezcan sustancialmente o se aíslen hasta homogeneidad.

La técnica actualmente no consigue enseñar un método eficaz para la expansión de células madre renovables sin una capa nutritiva.

CD38 es un miembro de una familia emergente de enzimas citosólicas y unidas a la membrana cuyo sustrato es nicotinamida adenin dinucleótido (NAD) , una coenzima distribuida de forma ubicua en la naturaleza. En el ser humano, CD38 es una glucoproteína trans-membrana de tipo II de 45 kDa. Recientemente, se ha demostrado que CD38 es una enzima multifuncional que ejerce actividad NAD+ glucohidrolasa y actividad ADP-ribosil ciclasa y, por lo tanto, es capaz de producir nicotinamida, ADP-ribosa (ADPR) , ADPR cíclica (cADPR) y ácido nicotínico adenin dinucleótido fosfato (NAADP) a partir de sus sustratos (Howard et al., 1993 Science 252: 1056-1059; Lee et al., 1999 Biol. Chem. 380; 785-793) . El dominio soluble de CD38 humano cataliza la conversión de NAD+ en ADP cíclicoribosa y en ADP-ribosa mediante un intermedio covalente común (Sauve, A. A., Deng, H. T., Angelletti, R. H., y Schramm, V. L. (2000) J. Am. Chem. Soc. 122, 7855-7859) .

Sin embargo, se descubrió además que CD38 no solamente se caracteriza por actividad multienzimática, sino que es capaz además de movilizar calcio, de transducir señales y de adherirse a hialuronano y a otros ligandos. La interacción con CD38 en diversas subpoblaciones de leucocitos tiene efectos profundos aunque diversos sobre su esperanza de vida (Funaro A, Malavasi F J Biol Regul Homeost Agents, Enero-Marzo de 1999; 13 (1) : 54-61 Human CD38, a surface receptor, an enzyme, an adhesion molecule and not a simple marker) .

CD38 se expresa ampliamente en células obtenidas de forma hematopoyética y no hematopoyética. También se ha descubierto que los homólogos de CD38 se expresan en células del estroma de mamíferos (Bst-1) y en células aisladas del invertebrado Aplysia californica (Prasad GS, 1996, nature Structural Biol 3: 957-964) .

Dos de los metabolitos producidos por CD38, cADPR y NAADP, han demostrado inducir la liberación de calcio intracelular en células aisladas de tejidos de plantas, invertebrados y mamíferos, lo que sugiere que estos metabolitos pueden ser reguladores globales de las respuestas al calcio (Lee et al., 1999 Biol. Chem. 380; 785-793) . Se sabe que tanto cADPR como NAADP inducen la liberación de calcio de depósitos de calcio que son distintos de los controlados por receptores de Ip3 (Clapper, D L et al., 1987, J. Biological Chem. 262: 9561-9568) .

Por lo tanto, CD38, siendo la ADP-ribosil ciclasa de mamífero mejor caracterizada, se postula para ser una importante fuente de ADP-ribosa cíclica in vivo.

Los iones de calcio nucleoplásmico (Ca+2) influyen en gran medida sobre funciones nucleares importantes tales como la transcripción génica, apoptosis, reparación de ADN, activación de topoisomerasa y desplegamiento de polimerasa. Aunque los receptores de inositol trisfosfato y los receptores rianodina, que son tipos de canal de Ca+2, están presentes en la membrana nuclear, su papel en la homeostasis de Ca+2 nuclear sigue sin estar claro.

Se descubrió que CD38/ADP-ribosil ciclasa tiene su sitio catalítico dentro del nucleoplasma y, por lo tanto, cataliza la cliclación intranuclear de NAD+, para producir cADPR nucleoplásmico. Este último activa los receptores de rianodina de la membrana nuclear interna para desencadenar la liberación de Ca+2 nucleoplásmico (Adebanjo OA et al. Nat Cell Biol noviembre de 1999; 1 (7) : 409-14 A new function for CD38/ADP-ribosyl cyclase in nuclear Ca2+ homeostasis) .

Se descubrió además que los agonistas de receptores de rianodina sensibilizan la liberación de calcio mediada por cADPR y los antagonistas de receptores de rianodina bloquean la liberación de calcio dependiente de cADPR (Galione A et al., 1991, Science 253: 143-146) . Por lo tanto, se ha propuesto que es probable que cADPR regule las respuestas al calcio en tejidos tales como músculo y páncreas, en los que los receptores de rianodina se expresan (Day et al., 2000 Parasitol 120: 417-422; Silva et al., 1998, Biochem. Pharmacol 56: 997-1003) . También se ha demostrado que, en células de músculo liso de mamífero, la liberación de calcio en respuesta a acetilcolina puede bloquearse no solamente con antagonistas del receptor de rianodina, sino también con antagonistas específicos de cADPR tales como 8-NH2-cADPR o 8-Br-cADPR (Guse, A H, 1999, Cell. Signal. 11: 309-316) . Estos descubrimientos, así como otros, indican que los agonistas/antagonistas del receptor de rianodina tales como cADPR pueden regular las respuestas al calcio en células aisladas de diversas especies.

Como se ha descrito anteriormente en este documento, la auto-renovación de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HPC) , tanto in vivo como in vitro, está limitada por la diferenciación celular. La diferenciación en el sistema hematopoyético implica, entre otros cambios, la expresión alterada de antígenos de superficie (Sieff C, Bicknell D, Caine G, Robinson J, Lam G,... [Seguir leyendo]

1. Un método de expansión de una población de células madre hematopoyéticas CD34+ ex vivo, mientras al

mismo tiempo, se inhibe la diferenciación de dichas células madre ex vivo, comprendiendo el método: a) cultivar dichas células madre ex vivo CD34+ bajo condiciones que permiten la proliferación celular, comprendiendo dichas condiciones las que proporcionan nutrientes, suero y una combinación de citoquinas incluyendo factor de células madre, trombopoyetina, ligando FLt3, IL6 e IL-3, y b) en el mismo medio de cultivo añadir nicotinamida en una cantidad de entre 1, 0 mM a 10 mM,

en el que dichas células son cultivadas durante un período de cultivo que da como resultado la expansión de la población de células madre hematopoyéticas CD34+ mientras se inhibe la diferenciación de dichas células madre hematopoyéticas CD34+ ex vivo, para producir una población expandida de células madre hematopoyéticas CD34+ con una mayor proporción de células CD34+/Lin- y CD34+/CD38- en el cultivo expandido, en comparación con las células CD34+ cultivadas en presencia de citoquinas y nutrientes, sin nicotinamida añadida exógenamente.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dichas células madre hematopoyéticas se obtienen de una fuente seleccionada entre el grupo constituido por: médula ósea, sangre periférica y sangre del cordón umbilical de neonato.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dichas células hematopoyéticas expandidas están caracterizadas además por una ausencia, o una expresión significativamente reducida de antígenos de superficie celular, CD3, CD61, CD19, CD33, CD14, CD15 o CD4.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dicha combinación de citoquinas comprende además al menos una citoquina seleccionada de entre el grupo que consiste en: interleuquina-1, interleuquina-2, interleuquina-10, interleuquina-12 y factor de necrosis tumoral.

5. El método de la reivindicación 1, en el que dicha combinación de citoquinas comprende además, citoquinas de acción tardía.

6. El método de la reivindicación 5, en el que dichas citoquinas de acción tardía se seleccionan entre el grupo constituido por: factor estimulador de colonias de granulocitos, factor estimulador de colonias de granulocitos/macrófagos, eritropoyetina, FGF, EGF, NGF, VEGF, LIF, factor de crecimiento de hepatocitos y factor estimulador de colonias de macrófagos.

7. El método de la reivindicación 1, en el que dicho cultivo de dichas células en presencia de dicha nicotinamida añadida exógenamente es para un período de hasta tres semanas.

8. El método de la reivindicación 1, donde dichas células se cultivan en presencia de 1, 0 mM de nicotinamida añadida exógenamente.

9. El método de la reivindicación 1, donde dichas células se cultivan en presencia de 5, 0 mM de nicotinamida añadida exógenamente.

10. El método de la reivindicación 1, donde dichas células se cultivan en presencia de 10, 0 mM de nicotinamida añadida exógenamente.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

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