Epítopos T de antígenos de preprocalcitonina.

Péptido inmunogónico que constituye un epítopo T presentado por CMH I,

caracterizado porque se selecciona entre:

a) el péptido de secuencia: VLLQAGSLHA (SEQ ID NO: 1)

b) el péptido de secuencia: LVLLQAGSLHA (SEQ ID NO: 2),

c) derivados de los mismos que tienen las siguientes sustituciones:

- la sustitución del aminoácido N-terminal de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 con una tirosina, o la sustitución de la valina N-terminal de SEQ ID NO: 1, con una leucina; y/o

- la sustitución de la alanina C-terminal de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 con una valina o una leucina.

Epitopos T de antigenos de preprocalcitonina La presente invencion se refiere a epitopos T de preprocalcitonina y sus usos en la inmunoterapia de cancer.

El analisis de los CTL reactivos con el tumor obtenidos de pacientes con diversos tumores solidos habia conducido a prometer nuevos tratamientos para enfermedades malignas, expandiendo los linfocitos T in vitro antes de transferirlos con IL-2 a los pacientes (GATTINONI y col., Nat Rev Immunol, 6, 383-93, 2006) , o identificando su Ag

diana que despues puedan usarse en vacunas terapeuticas. Se han identificado un gran numero de Ag asociados a tumores reconocidos por los CTL, obtenidos de PBL o linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) . La mayor parte de este trabajo se realizo con tumores de melanoma maligno. Desafortunadamente, los estudios clinicos indican que a pesar de un aumento en la frecuencia de los linfocitos T CD8 dirigidos contra tumor, la eficacia de las vacunas terapeuticas actuales es aun limitada en pacientes de melanoma metastasico (ROSENBERG y col., Nat Med, 10, 909-15, 2004) .

Los estudios actuales se centran en una mejor comprension de los mecanismos de las regresiones de tumores raros observados (GERMEAU y col., J Exp Med, 201, 241-8, 2005; LURQUIN y col., J Exp Med, 201, 249-57, 2005) , el estado de activacion de los linfocitos T CD8 dirigidos contra la vacuna y su capacidad para migrar al sitio de tumor y en la determinacion de los mecanismos locales que gobiernan la coexistencia pacifica de linfocitos T especificos de tumor y celulas tumorales.

Mucho menos se conoce acerca de la antigenicidad y susceptibilidad al ataque de CTL de tumores pulmonares humanos. La mayor parte de estos tumores son carcinomas pulmonares de celulas no pequenas (CPCNP) , un gran grupo que incluye carcinomas de celulas escamosas (CCE) , adenocarcinomas (ADC) y carcinomas de celulas grandes (CCG) carcinomas. El CPCNP puede infiltrarse por linfocitos TCR / (ECHCHAKIR y col., Int Immunol, 12, 537-46, 2000) . Los Ag diana de linfocitos T identificados incluyen peptidos codificados por el proto-oncogen HER2 / neu (YOSHINO y col., Cancer Res, 54, 3387-90, 1994) , que se expresa en exceso en muchos tumores pulmonares, y por varios genes que se descubrio que contenian una mutacion puntual en celulas tumorales en comparacion con las celulas autologas normales. Estos genes mutados incluyen el factor de elongacion 2 (HOGAN y col., Cancer Res, 58, 5144-50, 1998) , enzima malica (KARANIKAS y col., Cancer Res, 61, 3718-24, 2001) , -actinina-4 mutada (ECHCHAKIR y col., Cancer Res, 61, 4078-83, 2001) y NFYC (TAKENOYAMA y col., Int J Cancer, 118, 1992-7, 2006) . Ademas, se expresan varios genes cancerosos / de linea germinal en el CPCNP (WEYNANTS y col., Int J Cancer, 56, 826-9, 1994; SHICHIJO y col., Int J Cancer, 64, 158-65, 1995; YOSHIMATSU y col., J Surg Oncol, 67, 126-9, 1998; JANG y col., Cancer Res, 61, 7959-63, 2001; GRUNWALD y col., Int J Cancer, 118, 2522-8, 2006) , que deben conducir a la presencia de Ag especificos de tumor en la superficie de las celulas cancerosas. Sin embargo, las respuestas espontaneas a linfocitos T contra Ag de tipo MAGE hasta el momento no se han observado en pacientes de cancer de pulmon. Por lo tanto, la identificacion de nuevos Ag de cancer de pulmon, en particular los compartidos por tumores de varios pacientes, ayudara en el diseno y control inmunologico de nuevas estrategias de vacunacion en el cancer de pulmon.

La mayor parte de los peptidos antigenicos reconocidos por los linfocitos T CD8 se originan de la degradacion en los proteasomas de proteinas intracelulares maduras y su transporte, por el transportador asociado con el procesamiento de antigenos (TAP) , del citosol en el ER (para revision, vease ROCK & GOLDBERG, Annu Rev Immunol, 17, 739-79, 1999) . Los peptidos resultantes de 9 a 10 aa unen moleculas de CMH de clase I (CMH-I) y despues se transmiten a la superficie celular. Se ha indicado un numero creciente de los epitopos reconocidos por 45 los linfocitos T reactivos con el tumor como resultado de los mecanismos no clasicos que actuan a nivel de transcripcion, empalme o translacional (para revision, vease MAYRAND & GREEN, Immunol Today, 19, 551-6, 1998) . Cabe destacar que varios epitopos tumorales se procesan escasamente por las CD, que son unicas en su capacidad de procesar Ag y de cebar linfocitos T CD8, pero que expresan de forma constitutiva inmunoproteasomas (MOREL y col., Immunity, 12, 107-17, 2000; CHAPATTE y col., Cancer Res, 66, 5461-8, 2006) .

50 Los inventores han identificado un epitopo peptidico reconocido en un carcinoma pulmonar de celulas no pequenas humano por un clon de linfocitos T citotoxicos obtenido de linfocitos infiltrantes de tumor autologos. Descubrieron que este peptido, que esta presente por HLA-A2, se obtiene a partir de la region carboxi-terminal del peptido senal de la preprocalcitonina, y se procesa independientemente de los proteasomas y el transportador asociado con el 55 procesamiento de antigenos.

La preprocalcitonina se codifica por el gen CALCA, que tambien codifica el peptido relacionado con el gen de la -calcitonina ( -CGRP) . El gen CALCA incluye 5 intrones y 6 exones y su transcrito de ARN primario muestra un empalme alternativo especifico de tumor (JONAS y col., Proc Natl Acad Sci USA, 82, 1994-8, 1985; ROSENFELD y col., Nature, 304, 129-35, 1983) . Los exones 1, 2, 3 y 4 estan unidos para producir el ARNm de la calcitonina en linfocitos C tiroideos, mientras que los exones 1, 2, 3, 5 y 6 forman el ARNm de -CGRP en las celulas neuronales (MORRIS y col., Nature, 308, 746-8, 1984) . El -CGRP maduro es un peptido endogeno vasodilatador de 37 aa distribuido ampliamente en el cuerpo (ZAIDI y col., Crit Rev Clin Lab Sci, 28, 109-74, 1990) . El ARNm de la calcitonina codifica una proteina precursora de 141 aminoacidos, la preprocalcitonina, que incluye una secuencia senal N-terminal de 25 residuos. La escision de la secuencia senal da como resultado la procalcitonina, que contiene 116 aa, que comprende una region N-terminal (57 aa) , la propia calcitonina (32 aa) , y un peptido C-terminal, la catacalcina (21 aa) (ROSENFELD y col., Nature, 304, 129-35, 1983) . La secuencia senal de la preprocalcitonina tambien esta presente en la preprohormona del -CGRP.

La calcitonina es una hormona que participa principalmente en la proteccion del esqueleto durante periodos de "estres calcico", tales como el crecimiento, el embarazo y la lactancia (STEVENSON y col., Lancet, 2, 769-70, 1979; AUSTIN & HEATH, N Engl J Med, 304, 269-78, 1981) . Tambien se sabe que la calcitonina se produce a altos niveles por el carcinoma medular tiroideo (CMT) y por algunos carcinomas pulmonares (COOMBES y col., Lancet, 1, 1080

3, 1974; MILHAUD y col., Lancet, 1, 462-3, 1974) . Los niveles en plasma elevados de calcitonina son marcadores de diagnostico y pronostico en estos tumores (COOMBES y col., Lancet, 1, 1080-3, 1974) . No se comprende bien la expresion aberrante del gen CALCA en celulas de cancer de pulmon, pero se produce en parte de la desmetilacion del promotor (BAYLIN y col., Cancer Res, 46, 2917-22, 1986) y la perdida de represion transcripcional (SYMES y col., FEBS Lett, 306, 229-33, 1992) .

Se ha propuesto el uso de celulas dendriticas (DC) pulsadas con el polipeptido maduro de calcitonina para la inmunoterapia de CMT (SCHOTT y col., Cancer Immunol Immunother, 51, 663-8, 2002) . Sin embargo, hasta ahora no se habia sugerido que otras regiones del precursor de la calcitonina pudieran formar parte en la induccion de una respuesta inmune dirigida contra el tumor.

En consecuencia, en este documento se describe un peptido inmunogenico aislado que constituye un epitopo T presentado por CMH-I, caracterizado porque consiste en un fragmento de 8 a 11 aminoacidos consecutivos de preprocalcitonina, y mas especificamente del peptido senal de los mismos.

De acuerdo con la invencion, dicho peptido consiste en la secuencia (codigo de una letra) VLLQAGSLHA (SEQ ID NO: 1) . Preferiblemente, dicho peptido se selecciona entre un peptido que tiene la secuencia VLLQAGSLHA (SEQ ID NO: 1) , y un peptido que tiene la secuencia LVLLQAGSLHA (SEQ ID NO: 2) .

Opcionalmente, este peptido puede modificarse adicionalmente con el fin de aumentar su inmunogenicidad, 35 mediante la sustitucion de uno o mas de los aminoacidos de la secuencia nativa con uno o mas aminoacidos favorables a la afinidad para HLA-A2 y / o para la estabilidad del complejo peptido / molecula HLA-A2.

Las sustituciones que hacen posible aumentar la inmunogenicidad de un peptido de la invencion son:

- la sustitucion del aminoacido N-terminal de dicho peptido con una tirosina,... [Seguir leyendo]

1. Peptido inmunogenico que constituye un epitopo T presentado por CMH I, caracteriºado porºue se selecciona entre:

a) el peptido de secuencia: VLLQAGSLHA (SEQ ID NO: 1) b) el peptido de secuencia: LVLLQAGSLHA (SEQ ID NO: 2) , c) derivados de los mismos que tienen las siguientes sustituciones:

- la sustitucion del aminoacido N-terminal de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 con una tirosina, o la sustitucion de la valina N-terminal de SEQ ID NO: 1, con una leucina; y/o

- la sustitucion de la alanina C-terminal de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 con una valina o una leucina.

2. Peptido inmunogenico de acuerdo con la reivindicacion 1, caracteriºado porºue se selecciona entre el grupo que consiste en YL-LQAGSLHV (SEQ ID NO: 10) , VLLQAGSLHV (SEQ ID NO: 11) , VLLQAGSLHL (SEQ ID NO: 12) y LLLQAGSLHV (SEQ ID NO: 13) .

3. Un polipeptido quimerico que consiste en al menos una copia de un peptido de acuerdo con la 20 reivindicacion 1 o 2, condensado a un polipeptido heterologo.

4. Polinucleotido que codifica un peptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 o un polipeptido quimerico de la reivindicacion 3.

5. Composicion que comprende un peptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 o un polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion 4.

6. Composicion de acuerdo con la reivindicacion 5, caracteriºada porºue es una composicion multiepitopo que comprende adicionalmente uno o mas peptidos inmunogenicos o uno o mas polinucleotidos que 30 codifican dicho otro peptido o peptidos inmunogenicos.

7. Composicion de acuerdo con la reivindicacion 6, caracteriºada porºue comprende un polipeptido quimerico de la reivindicacion 3 que comprende al menos una copia de un peptido de acuerdo con la reivindicacion 1

o 2 y al menos una copia de otro peptido inmunogenico, o un polinucleotido que codifica dicho polipeptido quimerico. 35

8. Composicion que comprende celulas dendriticas, caracteriºada porºue dichas celulas dendriticas se pulsan con un peptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, y opcionalmente con uno o mas peptidos inmunogenicos diferentes, o se transforman con un polinucleotido de la reivindicacion 4.

40 9. Un peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, o un polipeptido quimerico de la reivindicacion 3, o un polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion 4, o una composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, para su uso como un medicamento.

10. Un peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, o un polipeptido quimerico de 45 la reivindicacion 3, o un polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion 4, o una composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, para su uso de acuerdo con la reivindicacion 9, caracteriºado porºue dicho medicamento esta disenado para inmunoterapia antitumoral.

11. Un peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, o un polipeptido quimerico de 50 la reivindicacion 3, o un polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion 4, o una composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, caracteriºado porºue dicho medicamento esta disenado para la inmunoterapia de tumores que expresan preprocalcitonina y/o -CGRP.

12. Un peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, o un polipeptido quimerico de 55 la reivindicacion 3, o un polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion 4, o una composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracteriºado porºue dicho medicamento esta disenado para el tratamiento de pacientes HLA-A*0201.