MITF como marcador para la predisposición al cáncer.

Procedimiento para determinar si un sujeto tiene una predisposición o una susceptibilidad para desarrollar un cáncer elegido entre un melanoma cutáneo maligno,

un cáncer de riñón y combinaciones de los mismos, que comprende determinar en una muestra biológica del sujeto si MITF (factor de transcripción asociado a la microftalmia) presenta o no una mutación que disminuye o impide la sumoilación de MITF, en donde la presencia de esta mutación es indicativa de que el sujeto tiene una predisposición o una susceptibilidad para desarrollar tal cáncer.

MITF como marcador para la predisposición al cáncer

La presente solicitud se refiere al ámbito médico y, más en particular, al de la determinación de una predisposición a desarrollar un cáncer.

En aproximadamente el 5% de los cánceres, las mutaciones constitucionales que activan los oncogenes o que inactivan los genes supresores de tumores (denominados genes importantes o con efectos fuertes) confieren a los portadores un alto riesgo (superior al 5% en el transcurso de la vida) de desarrollar un cáncer, están en el origen de las formas familiares, de la aparición en un sujeto joven o de episodios múltiples. La expresión de la enfermedad puede variar bajo la influencia de otros factores genéticos (denominados modificadores, genes con efectos débiles) o ambientales. La identificación de las personas en riesgo permite que se puedan beneficiar de medidas de prevención y de vigilancia dirigidas a una detección precoz. En algunos casos, la mutación germinal constitucional puede orientar el tratamiento antineoplásico, como es el caso de los tratamientos anti-PARP en las pacientes portadoras de mutaciones germinales de BRCA1 y BRCA2 (Hennessy B. T. J., JCO, 21, 28, 357-3576).

El melanoma es un tumor maligno de los melanocitos. Se trata de uno de los cánceres de piel más infrecuentes, pero es la causa de la mayoría de muertes debidas al cáncer de piel. A pesar de los muchos años de investigación intensiva, el único tratamiento eficaz es la extirpación quirúrgica del tumor primario antes de que alcance un grosor de más de 1 mm. Según un informe de la OMS, hay aproximadamente 48. muertes al año relacionadas con los melanomas. En varios estudios se ha debatido si en los pacientes con melanomas cutáneos aumenta el riesgo de desarrollar un cáncer de mama, un linfoma o un cáncer de riñón.

En cuanto al melanoma, hasta la fecha se han identificado dos genes con efecto fuerte, CDKN2A que codifica las proteínas p16INK4A y p14ARF, y CDK4. El factor ambiental principal es la exposición a los rayos UV. Los genes conocidos que tienen efectos débiles son principalmente genes que codifican proteínas implicadas en la pigmentación, de los que MC1R es el más estudiado hasta la fecha. En el 5% de las familias con tres casos de melanoma no se ha identificado un gen de predisposición.

En este contexto, los inventores han estudiado que el gen MITF, el gen principal de regulación del melanocito (1) y oncogén (2, 3), puede ser un gen candidato de predisposición al melanoma. El MITF es un factor de transcripción de la familia bHLH-LZ que desempeña una función importante en la supervivencia y en el desarrollo de los melanocitos. El MITF interviene en la regulación de la melanogénesis. La función del MITF no es corriente porque es a la vez inductor y represor de la proliferación celular. En efecto, este factor es necesario, por una parte, para la diferenciación terminal de los melanocitos y/o la pigmentación y, por otra parte, para el comportamiento maligno que induce la proliferación celular. Las mutaciones constitucionales por «pérdida de función» del MITF están asociados a las enfermedades autosómicas dominantes, en particular el síndrome de Waardenburg y el síndrome de Tietz, que se caracterizan por una sordera con anomalías de pigmentación de la piel, del cabello y/o del iris.

El gen MITF comprende 9 exones. Se han identificado seis isoformas del MITF. En los humanos se definen por regla general como las isoformas 1 a 6, en donde la isoforma 4 es la más conocida con el nombre de isoforma M. En el ratón se utiliza bastante la nomenclatura con letras. Estas isoformas se transcriben desde promotores específicos. Además, se distinguen por su región del extremo amino y contienen todos los exones de 2 a 9 puesto que el exón 1 es el específico de cada isoforma (1). La isoforma 4, que se denomina con más frecuencia MITF-M, se diferencia de las otras isoformas por una inserción de seis aminoácidos. Esta isoforma se ha detectado solo en los melanocitos o en las células transformadas in vivo (nevo, melanoma, etc) o derivadas in vitro (líneas). Las otras isoformas se expresan en muchos tejidos y líneas celulares, a veces también con especificidad de tejido.

La solicitud de patente internacional WO /47765 da a conocer que el ayuste alternativo del gen MITF produce los transcritos mitf+ y mitf- que codifican proteínas que difieren en la inserción de seis aminoácidos adicionales en mitf+. La expresión de mitf+ y de mitf- predomina en las células sanas y tumorales, respectivamente. Esta solicitud de patente da a conocer, así pues, un procedimiento semicuantitativo para evaluar, predecir o vigilar el riesgo y el tratamiento de los melanomas. De igual forma, la solicitud de patente internacional WO 5/116249 describe un procedimiento cuantitativo basado en estas variantes de ayuste del MITF.

Cronin et al. (Pigment Cell & Melanoma Research, 29, 22, 435-444) y Yokoyama et al. (Pigment Cell & Melanoma Research, 29, 22, 376-377) describen las mutaciones del gen MITF identificadas en las muestras de melanoma. En Murakami et al. (Pigment Cell Research, 25, 18, 265-277) se describe el efecto de la sumoilación sobre la actividad transcripcional del MITF. Miller et al. (J. Biol. Chem., 25, 28, 146-155) describe mutaciones sobre los sitios de la sumoilación del MITF que impiden la sumoilación y modifican la actividad transcripcional del MITF.

En la presente invención, los inventores han identificado una mutación constitucional recurrente del gen MITF, denominada aquí E318K (según la nomenclatura de la isoforma 4), que es útil como marcador de la predisposición al cáncer.

El alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones. Los elementos que quedan fuera de este alcance se aportan sólo con fines informativos.

El gen MITF (factor de transcripción asociado a la microftalmia) lo conoce bien el experto en la técnica y se puede caracterizar por su referencia en las bases de datos tales como UniGene (Hs. 16617), HomoloGene (4892) y GeneID (4286). También se denomina MI, WS2A o bHLHe32.

Esta mutación E318K está localizada en el exón 9 del gen MITF, en particular, en la posición 952 de la ¡soforma M según la nomenclatura HGVS. Consiste en la sustitución de un nucleótido G por un nucleótido A (c.952G>A) y da lugar a la sustitución de un ácido glutámico por una lisina (p.Glu318Lys). Este exón 9 está en todas las variantes de ayuste del MITF. En la ¡soforma MITF-M, este resto se encuentra en la posición 952 del transcrito y provoca la mutación del aminoácido de la posición 318. La terminología «mutación E318K» designa la mutación, cualquiera que sea su posición en las isoformas del MITF. En particular, la posición del nucleótido mutado y del aminoácido en las diferentes variantes de ayuste se indica a continuación.

El mutante E318K del MITF tiene una actividad más fuerte que el MITF silvestre con respecto a la activación de la transcripción del gen HIF1A, el cual se sabe que desempeña una función importante en la carclnogenla renal (activado secundariamente por las mutaciones de «pérdida de función» de los genes de predisposición al cáncer de riñón, tales como VHL, FH, SDHB). Además, se ha establecido que esta mutación disminuye la sumollaclón del MITF, lo que influye así quizás en la estabilidad de la proteína o en la cantidad de proteínas codificadas por los genes diana. En efecto, el aminoácido E318 forma parte de uno de esos sitios de sumoilación de la proteína MITF. El gen MITF, que codifica un factor de transcripción, la proteína MITF con la mutación E318K, es capaz de activar constitutivamente... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para determinar si un sujeto tiene una predisposición o una susceptibilidad para desarrollar un cáncer elegido entre un melanoma cutáneo maligno, un cáncer de riñón y combinaciones de los mismos, que comprende determinar en una muestra biológica del sujeto si MITF (factor de transcripción asociado a la microftalmia) presenta o no una mutación que disminuye o impide la sumoilación de MITF, en donde la presencia de esta mutación es indicativa de que el sujeto tiene una predisposición o una susceptibilidad para desarrollar tal cáncer.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la mutación en MITF es una sustitución de un resto de lisina y/o de un resto de ácido glutámico de uno de los sitios de sumoilación de MITF o de los dos sitios.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la mutación es la sustitución de un resto seleccionado de la siguiente tabla por cualquiera de los otros 19 aminoácidos.

Isoforma SEQ Ref. Ref. Primer sitio de Segundo sitio de

ID n.° Transcrito Proteína sumoilación sumoilación

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la mutación es una sustitución de K316 o de E318 de la isoforma 4 o del resto que corresponde en las otras isoformas de MITF.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la mutación es una sustitución de E318 de la isoforma 4 o del resto que corresponde en las otras isoformas de MITF, preferiblemente por un resto de lisina.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones, en el que la mutación se detecta en la proteína o en el ácido nucleico.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, que comprende

la secuenciación completa o parcial de MITF, en particular de la región que comprende el resto que se sospecha que está mutado e incluso únicamente la secuenciación de este resto concreto; o

la puesta de manifiesto del ADN genómico, del ARN o del ADNc con una sonda específica del muíante de MITF y finalmente con una sonda de control que es específica del MITF que no presenta esta mutación o del MITF silvestre; o

la amplificación selectiva del mutante con una pareja de cebadores, en donde uno de los cebadores se híbrida específicamente con la secuencia que lleva la mutación a detectar.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la mutación se detecta indirectamente mediante la medición de la sumoilación de MITF, en donde una disminución de la sumoilación respecto a la proteína MITF silvestre indica la presencia de la mutación E318K.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la mutación se detecta por la determinación de la localización celular de MITF en inmunohistoquímica, en donde una localización nuclear es indicativa de la proteína MITF silvestre, mientras que una localización nuclear y citoplasmática es indicativa de la proteína MITF

con la mutación E318K.

1. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones, en donde el cáncer es la combinación de un melanoma cutáneo maligno y de un cáncer de riñón.

11. Utilización in vitro de medios de detección de una mutación de MITF que disminuye o impide la

sumoilación de MITF para determinar si un sujeto presenta o no una predisposición o una susceptibilidad para

desarrollar un cáncer elegido de la lista siguiente: un melanoma cutáneo maligno, un cáncer de riñón y combinaciones de los mismos.

12. Utilización según la reivindicación 11, en la que los medios de detección pueden comprender o consistir en una sonda específica de MITF que lleva la mutación a detectar, una pareja de cebadores que

permite la amplificación de un segmento nucleotídico que comprende la mutación a detectar, una pareja de

cebadores de los que uno de ellos se híbrida específicamente con la secuencia que lleva la mutación a detectar, un anticuerpo específico del muíante de MITF a detectar, medios que permiten la detección y la medición de la sumoilación de MITF, controles negativos que permiten detectar que MITF no presenta la mutación a detectar, o combinaciones de los mismos.

13. Utilización según la reivindicación 11 o 12, en la que la mutación es la sustitución de un resto

seleccionado de la tabla que viene a continuación por cualquiera de los otros 19 aminoácidos.

Isoforma SEQ Ref. Ref. Primer sitio de Segundo sitio de

ID n.° Transcrito Proteína sumoilación sumoilación

14. Utilización según la reivindicación 13, en la que la mutación es una sustitución de K316 o de E318 de la isoforma 4 o del resto que corresponde en las otras isoformas de MITF.

15. Utilización según la reivindicación 15, en la que la mutación es una sustituciones de E318 de la

isoforma 4 o del resto que corresponde en las otras isoformas de MITF, preferiblemente por un resto de lisina.