Ensayo de seguridad de fármacos mediante la utilización de pentraxina-3 (PTX-3).

Un método in vitro para la determinación del riesgo de un compuesto de inducir un síndrome de liberación decitocinas en un humano que incluye los pasos de:

a) proporcionar una muestra de sangre total, donde dicha sangre se expuso al compuesto, al menos durante30 minutos.

b) medir el nivel de pentraxina-3 (PTX-3) en dicha muestra, y

c) comparar el nivel medido de pentraxina-3 con un control, donde el control es el nivel de pentraxina-3 deuna muestra sangre total no expuesta, donde un aumento significativo del nivel de pentraxina-3, encomparación con el control indica un riego para dicho compuesto de inducir un síndrome de liberación decitocinas.

Ensayo de seguridad de fármacos mediante la utilización de pentraxina-3 (PTX-3)

En el pasado, la administración de anticuerpos terapéuticos ha causado serios efectos secundarios relacionados con la primera infusión de dichos anticuerpos durante los estudios clínicos. Se ha descrito la liberación aguda en la circulación de cantidades excesivas de determinadas citocinas proinflamatorias y se cree que esto es crítico como causa de un compendio de síntomas, lo que se conoce como síndrome de liberación de citocinas (CRS) . Habitualmente, el CRS comienza 20-90 min. después de la infusión y resulta de la liberación de citocinas desde las células a las que va dirigido el anticuerpo, así como desde las células inmunológicas efectoras activadas mediante la unión del anticuerpo a los receptores Fc. Cuando las citocinas se liberan en la circulación, pueden aparecer síntomas sistémicos tales como fiebre, náuseas, escalofríos, hipotensión, taquicardia, astenia, cefalea, erupción cutánea, picor en la garganta y disnea. En la mayoría de los pacientes, los síntomas son leves o moderados, con relación a la severidad, y se pueden manejar fácilmente. No obstante, a causa de una liberación masiva de citocinas, algunos pacientes pueden experimentar reacciones severas que son una amenaza para la vida.

Dado que el CRS es un acontecimiento específico de una especie y no se puede observar en modelos animales convencionales para el ensayo de fármacos, se necesitan modelos in vitro basados en células derivadas de la sangre humana para evaluar el riesgo de la liberación de citocinas de los nuevos productos medicinales. Se conocen ensayos que miden los niveles de citocinas en el suero del plasma sanguíneo (WingMG et aL, Ther Immunol. 1995, 2 (4) : 183-190) . No obstante, el aumento de las citocinas clásicas, tales como el TNF-a, el IFN-y 0 las interleucinas, no siempre es predictivo de los casos de CRS. Además, con los ensayos disponibles, se detecta la liberación de citocinas en las muestras de sangre sólo tras un periodo considerable de tiempo después de un potencial evento adverso. De este modo, existe al necesidad de proporcionar un método fiable y más rápido para determinar el riesgo asociado a un compuesto de producir el CRS. Este problema se soluciona mediante la presente invención, en particular, mediante la utilización de pentraxina-3 (PTX-3) para la determinación del riesgo de un compuesto en relación a la inducción de reacciones de infusión relacionadas con la liberación de citocinas.

La presente invención proporciona un nuevo método para la determinación del riesgo de un compuesto de interés de inducir CRS en un individuo.

Dicho método incluye los pasos de:

a) proporcionar una muestra de sangre total, donde la muestra de sangre se expuso al compuesto, al menos durante 30 minutos.

b) medir el nivel de pentraxina-3 (PTX-3) en dicha muestra, y

c) comparar el nivel medido de pentraxina-3 con un control, donde el control es el nivel de pentraxina-3 de una muestra sangre total no expuesta, donde un aumento significativo del nivel de pentraxina-3, en comparación con el control, indica un riesgo para dicho compuesto de inducir un síndrome de liberación de citocinas.

Preferiblemente, el nivel de PTX-3 se mide en el plasma que se obtiene mediante la sustracción de las células sanguíneas de la muestra de sangre total. De manera alternativa, el nivel de PTX-3 también puede medirse en el suero obtenido a partir de una muestra de sangre total.

La inmunogenicidad hace referencia a la habilidad de una sustancia de activar una respuesta inmunitaria. Una respuesta inmunitaria es una reacción del sistema inmunológico a ciertas sustancias, mediada por las células B, las células T y las células del sistema inmunológico innato, tales como los monocitos, los macrófagos o los granulocitos neutrofílicos. Una reacción mediada por las células B involucra la producción y liberación de anticuerpos específicos para un antígeno. Las respuestas de las células T, los monocitos o los granulocitos involucran la liberación de citocinas proinflamatorias y/o antiinflamatorias. Una liberación aguda de cantidades excesivas de ciertas citocinas proinflamatorias en la circulación corporal se denomina "síndrome de liberación de citocinas” (CRS) .

Una citocina es una proteína soluble que actúa como mensajero entre las células, ya sea estimulando o inhibiendo la actividad de las diversas células del sistema inmunitario. Las citocinas incluyen linfocinas, monocinas, interleucinas e interferones.

El término "compuesto de interés", tal y como se utiliza aquí, hace referencia a una molécula biológica o química. Una molécula biológica puede ser, en particular, un polipéptido o un polinucleótido. Tales polipéptidos y polinucleótidos pueden tener modificaciones, tales como por ejemplo, metilaciones, pegilaciones, fosforilaciones y glicosilaciones.

El término "polipéptido", tal y como se utiliza aquí, hace referencia a una cadena de aminoácidos conectados mediante enlaces peptídicos. El término "polipéptido" incluye también una proteína y un péptido. Preferiblemente, un polipéptido es un anticuerpo, más preferiblemente, un anticuerpo terapéutico. Un anticuerpo terapéutico puede ser un anticuerpo humano o humanizado.

El término "polinucleótido", tal y como se utiliza aquí, hace referencia a un polímero de nucleótidos que incluye los nucleótidos A, C, G y T (o U) . Un polinucleótido es, por ejemplo, un oligonucleótido, un miRNA, un siRNA, un RNA antisentido, un mRNA o un cDNA.

Preferiblemente, un compuesto de interés es un compuesto terapéutico. Un compuesto terapéutico es un compuesto para su utilización en métodos curativos, incluyendo el alivio, la eliminación o la disminución de los síntomas o la prevención o reducción de la posibilidad de contraer cualquier trastorno o malfuncionamiento del cuerpo humano o animal. Un compuesto terapéutico puede ser una molécula biológica o química. Preferiblemente, un compuesto terapéutico biológico es un anticuerpo o un siRNA.

La pentraxina-3 (PTX-3) , también conocida como pentraxina-3, pertenece a una familia de proteínas conocida como “pentraxinas largas”, que se caracterizan por un domino pentraxina carboxiterminal (Basile et al, J Biol Chem. 1997, 272 (13) :8172-8) . El cDNA que codifica para esta proteína de 381 aminoácidos (SEC. ID Nº: 1) se ha clonado por Breviario et al (J Biol Chem., 1992, 267 (31) : 22190-22197) y se ha identificado como un gen la expresión del cual se induce por IL-1ºen las células endoteliales de la vena umbilical humana.

La pentraxina-3 se produce y se secreta en una variedad de tipos celulares. Las células mononucleares sanguíneas periféricas producen la proteína como respuesta a los lipopolisacáridos bacterianos, la IL-1º, y el TNF-a, per0 n0 como respuesta a IL-6, MCP-1, M-CSF, GM-CSF, o el IFN-y (Alles et al, Blood. 1994, 84 (10) :3483-93) . La pentraxina se expresa en las células endoteliales, los fibroblastos y los monocitos estimulados (Alles et al, 1994) , en las células dendríticas (Doni et al, Eur J Immunol. 2003, 33 (10) :2886-93) , los mioblastos indiferenciados y diferenciados (Introna et al, Blood. 1996, 87 (5) :1862-72) , en los sinoviocitos de la artritis reumatoide (Luchetti et al, Clin Exp Immunol. 2000, 119 (1) :196-202.) , en las células de la glía (Polentarutti et al, J Neuroimmunol. 1 de julio de 2000;106 (1-2) :8794) , en las células del sarcoma de Kaposi (inducible mediante la IL-6 viral) (Klouche et al, AIDS. 24 de mayo de 2002;16 (8) :F9-18) , macrófagos y células endoteliales e, infrecuentemente, en las células del músculo liso en las placas ateroescleróticas avanzadas (Rolph et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002; 22 (5) :e10-4) , las células mesangiales y endoteliales del glomérulo (Bussolati et al, J Immunol. 1 de febrero de 2003; 170 (3) :1466-72) , preadipocitos (Abderrahim-Ferkoune et al, J Lipid Res. 2003;44 (5) :994-1000) , células del cúmulo oóforo humano y murino (Salustri et al, Development. 2004; 131 (7) :1577-86) y en neutrófilos (Jaillon et al, JEM. 2007, 204 (4) :793-804; Imamura et al, Cell Immunol 2007, 248 (2) :86-94) .

El término "sangre total" tal y como se utiliza aquí, hace referencia a un fluido que contiene eritrocitos, leucocitos y plaquetas suspendidos en un fluido llamado plasma. Las muestras de sangre total pueden recogerse de cualquier animal. Preferiblemente, la muestra de sangre total se recoge de... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para la determinación del riesgo de un compuesto de inducir un síndrome de liberación de citocinas en un humano que incluye los pasos de:

a) proporcionar una muestra de sangre total, donde dicha sangre se expuso al compuesto, al menos durante 30 minutos.

b) medir el nivel de pentraxina-3 (PTX-3) en dicha muestra, y

c) comparar el nivel medido de pentraxina-3 con un control, donde el control es el nivel de pentraxina-3 de una muestra sangre total no expuesta, donde un aumento significativo del nivel de pentraxina-3, en comparación con el control indica un riego para dicho compuesto de inducir un síndrome de liberación de citocinas.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el nivel de PTX-3 se mide en el plasma o en el suero obtenido a partir de una muestra de sangre total.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde la sangre total contiene un anticoagulante.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 2, donde el plasma contiene un anticoagulante.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, donde el anticoagulante es heparina.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la incubación de la muestra de sangre total con un compuesto de interés se inicia en las 4 horas posteriores a la extracción de la muestra de sangre.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la muestra de sangre total se incuba con el compuesto de interés durante entre 30 minutos y 24 horas.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el nivel de pentraxina-3 se mide con un ELISA de quimioluminiscencia potenciada.