Ensayo de pirogenicidad para su uso con sistemas de inmunoensayo automáticos.

Método para detectar pirógenos en una muestra, que comprende los pasos de:

a) combinar un reactivo que contiene monocitos libre de pirógenos y la muestra a ensayar en un sistema deensayo libre de pirógenos, comprendiendo el sistema de ensayo al menos una superficie revestida con un anticuerpolibre de pirógenos para una citoquina o un anticuerpo libre de pirógenos para un mediador endógeno de la respuestainflamatoria; y

b) analizar el sistema de ensayo en cuanto a la presencia de citoquina o mediador unido al anticuerpo sobre lasuperficie; indicando un nivel elevado de citoquina o mediador unido a la superficie la presencia de pirógenos en lamuestra ensayada.

Ensayo de pirogenicidad para su uso con sistemas de inmunoensayo automáticos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un ensayo de pirogenicidad mejorado para su uso con sistemas de inmunoensayo automáticos, donde se incuba una muestra con un reactivo que contiene un monocito en un sistema de ensayo libre de pirógenos que comprende una superficie preferiblemente revestida con anticuerpos anticitoquina libres de pirógenos. La invención también se refiere a un sistema de ensayo libre de pirógenos revestido con anticuerpos libre de pirógenos para su uso en tales ensayos. La invención también se refiere a un ensayo para medir la producción basal de mediadores endógenos de la respuesta inflamatoria por leucocitos y a un método para medir la capacidad de los leucocitos para responder a un estímulo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Cuando ciertos compuestos químicos o biológicos entran en contacto con el sistema circulatorio en humanos u otros mamíferos provocan una respuesta sistémica caracterizada por un incremento de la temperatura corporal o fiebre. Estos materiales se denominan “pirógenos” o compuestos “pirogénicos”. Ciertos compuestos que representan un riesgo particular de pirogenicidad incluyen productos médicos que pueden ser inhalados, inyectados o infundidos, al igual que dispositivos médicos tales como membranas o materiales implantados. Incluso los nutrientes pueden representar riesgo de pirogenicidad. Además de la naturaleza pirogénica del propio producto o de los subproductos de su producción, con frecuencia la contaminación bacteriana del producto puede ser causa de pirogenicidad. Este problema persiste incluso si el producto se “esteriliza” con calor o por métodos químicos, ya que el principal componente pirogénico de las bacterias, las endotoxinas (o lipopolisacáridos con pared celular) , pueden permanecer una vez que las bacterias han muerto.

Normalmente, los compuestos que actúan como pirógenos estimulan la producción de citoquinas en monocitos después del contacto con tejidos, células o fluidos corporales. Son estas citoquinas producidas de forma endógena las que provocan la respuesta febril en el organismo afectado. Las citoquinas conocidas más importantes que producen fiebre son las proteínas interleuquina-1 (IL-1) , interleuquina-1ra (IL-1ra) , interleuquina-6 (IL-6) , interleuquina-8 (IL-8) y el factor de necrosis tumoral (TNF) , así como mediadores lipídicos de bajo peso molecular tales como prostaglandina E2 (PGE2) . Estos compuestos se ensayan rutinariamente mediante ELISA o con ensayos de inmunoadsorción ligada a enzimas (para IL-1, IL-6 o TNF) y EIA o inmunoensayo enzimático (para PGE2) .

Con el fin de evitar una reacción pirogénica y garantizar la seguridad de cualquier fármaco o producto farmacéutico administrado vía parenteral, es necesario controlar la contaminación pirogénica para identificar aquellos lotes individuales contaminados por bacterias. Actualmente se utilizan de forma rutinaria dos métodos farmacopólicos, el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) y el ensayo de pirógenos en conejos, para controlar la contaminación por pirógenos en productos farmacéuticos de producción en masa.

El ensayo en conejos es un ensayo in vivo que consiste en inyectar el compuesto a una cantidad estadísticamente significativa de conejos y observar el aumento medio de su temperatura corporal. Aunque el ensayo en conejos es sensible a una amplia gama de agentes pirógenos, incluyendo endotoxinas bacterianas, éste tiene una sensibilidad relativamente baja (de ng de endotoxina por ml) en comparación con otros ensayos pirogénicos (de pg de endotoxina por ml en el caso del ensayo LAL) . Además, la correlación inter-especie de las respuestas pirogénicas a los compuestos es, en el mejor de los casos, irregular. Por ejemplo, se ha documentado que la dosis de endotoxina bacteriana que provoca una respuesta pirogénica varía hasta 10.000 veces entre especies. Los ensayos en conejos tienen la desventaja adicional de tardar uno o dos días para una administración adecuada. El coste, la relativa falta de sensibilidad y los aspectos éticos que implican los experimentos con animales han hecho que el ensayo en conejos haya caído en desuso en los últimos años.

Entre los compuestos que provocan fiebre, uno de los mejor descritos es la endotoxina (lipopolisacárido, LPS) , que procede de la pared bacteriana de gérmenes gramnegativos (Moltz y col., Neurosci. Biobehav. Rev., 1993, 17, 237-269; Tilders y col., Psychoneuroendocrinology, 1994, 19, 209-232; Rothwell, Crit. Rev. Neurobiol., 1994, 8, 1-10; Zeisberger y Roth, Neuropsychobiology, 1993, 28, 106-109) . Por ello se pensó que, en general, resultaría útil sustituir los experimentos con conejos, que son costosos y requieren mucho tiempo, por un ensayo LAL de endotoxina directo. Este planteamiento tiene limitaciones obvias. El ensayo LAL es un ensayo in vitro muy sensible. Sin embargo, sólo detecta endotoxinas de bacterias gramnegativas y da resultados falso negativo con determinados productos que pueden estimular monocitos para producir citoquinas pirogénicas. El ensayo LAL también resulta alterado por los componentes de unión a la endotoxina presentes en la sangre o en componentes sanguíneos (Harris y col., J. Lab. Clin. Med., 1991, 118, 186-193; Emancipator y col., 1992, Infect. Immun., 60, 596-601; Read y col., Eur. Heart J., 1993, 14, 125-129) . Algunos de estos componentes de unión a endotoxina se unen a LPS e impiden que éstos sean detectados. Estos componentes también pueden influir en la reacción inmunológica con monocitos, es decir, en la reacción pirogénica primaria. Esta interferencia es problemática, ya que la prueba de pirógenos exógenos en productos sanguíneos es esencial para garantizar una administración segura de estos productos en un escenario clínico. Por otro lado, el ensayo de Limulus es tan sensible que fácilmente da falsos resultados positivos debido a impurezas que no son relevantes para la calidad del producto (Fujiwara y col., Yakugaku Zasshi, 1990, 110, 332-340) .

Se ha observado que la sangre total produce citoquinas cuando se añade endotoxina ex vivo. Después de incubar sangre total con lipopolisacárido Sal. minnesota durante seis horas, se pudo detectar un aumento de la IL-1 1 y el TNF-e en cultivo por ELISA (M.B. Finch y col., "Cytokine Production In Whole Blood ex vivo, " Agents Actions 34:49-52 (1991) ,

C.E. Desch y col., "Production of Human Tumor Necrosis Factor from Whole Blood Ex Vivo", Lymphokine Rsrch, 8:14146 (1989) ) . Además se ha observado que líneas celulares monocíticas cultivadas producen IL-11 e IL-6 cuando se incuban con endotoxina de E. coli, sugiriéndose que estas líneas celulares pueden utilizarse como ensayo de pirógenos efectivo (Taktak y col., "Assay of Pyrogens by Interleukin-6 Release from Monocytic Cell Lines, " J. Pharm. Pharmacol.143: 578-582 (1991) ) .

La Patente US nº 5.891.728 describe un método para poner en contacto una muestra de material potencialmente pirogénico con sangre total humana con el fin de liberar citoquinas de monocitos y otros leucocitos. Una ventaja de este procedimiento es que el uso de un reactivo biológico completo (sangre total) permite evaluar la exposición de humanos y otros mamíferos a los agentes pirogénicos en las muestras de ensayo. Todos los componentes sanguíneos necesarios para una interacción del pirógeno exógeno con leucocitos (por ejemplo, proteína de unión de LPS -- LBP, CD 14 soluble, etc.) están presentes. Después de incubar la muestra con sangre total en un recipiente de ensayo, la mezcla de incubación se centrifuga, clarifica y ensaya en cuanto a la presencia de citoquinas segregadas en un paso de inmunoensayo independiente.

Aunque este método de ensayo constituye una mejora con respecto al ensayo LAL, y potencialmente detecta una gran variedad de pirógenos exógenos además de la endotoxina, tiene varias desventajas que impiden o limitan seriamente su uso a escala industrial. Los dos pasos independientes de cultivo de la sangre con material de prueba y el ensayo del cultivo en cuanto a la producción de citoquina se realizan en recipientes separados, lo que requiere que el material cultivado sea transferido a un nuevo recipiente de inmunoensayo. La transferencia del material necesaria para estos pasos independientes no se puede llevar a cabo fácilmente utilizando equipos de ensayo de control de calidad modernos. Los ensayos de pirógenos se realizan normalmente (y preferentemente) de modo simultáneo, ensayando numerosos lotes de productos farmacéuticos en cuanto a la contaminación con pirógenos. Por consiguiente, existe la necesidad de un ensayo de pirogenicidad que pueda ser llevado a cabo en un sistema... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar pirógenos en una muestra, que comprende los pasos de:

a) combinar un reactivo que contiene monocitos libre de pirógenos y la muestra a ensayar en un sistema de ensayo libre de pirógenos, comprendiendo el sistema de ensayo al menos una superficie revestida con un anticuerpo libre de pirógenos para una citoquina o un anticuerpo libre de pirógenos para un mediador endógeno de la respuesta inflamatoria; y

b) analizar el sistema de ensayo en cuanto a la presencia de citoquina o mediador unido al anticuerpo sobre la superficie; indicando un nivel elevado de citoquina o mediador unido a la superficie la presencia de pirógenos en la muestra ensayada.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el reactivo que contiene monocitos comprende sangre total.

3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque la sangre total es sangre total humana.

4. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque el reactivo que contiene monocitos comprende adicionalmente un diluyente, un anticoagulante o una combinación de los mismos.

5. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque el diluyente es un medio RPMI.

6. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la citoquina se selecciona de entre el grupo consistente en interleuquina-1, interleuquina-1ra, interleuquina-6, interleuquina-8, factor de necrosis tumoral e y prostaglandina E2.

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque la citoquina es interleuquina-6.

8. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el mediador endógeno de la respuesta inflamatoria es endotelina.

9. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el sistema de ensayo incluye al menos un pocillo de microtitulación y la superficie sobre la que está aplicado el anticuerpo es una parte del interior del pocillo de microtitulación.

10. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque el pocillo de microtitulación está hecho de poliestireno o polipropileno.

11. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el sistema de ensayo se ensaya en cuanto a la citoquina mediante un ensayo colorimétrico de inmunoadsorción ligado a enzimas, un inmunoensayo radiomarcado o un inmunoensayo marcado con fluorescencia.

12. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo libre de pirógenos es un anticuerpo policlonal.

13. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo libre de pirógenos es un anticuerpo monoclonal.

14. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es un medicamento para la inyección o la infusión.

15. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es un producto sanguíneo.

Una placa Dos placas

Respuesta de citoquina (pg/ml)

Endotoxina (ng/ml)