Un ensayo para seleccionar un medicamento candidato para el tratamiento de enfermedades inflamatorias debido a la producción de citocinas,

dicho ensayo comprendiendo:

a) exponer dicho medicamento candidato a células intestinales; y

b) analizar el efecto de dicho medicamento candidato, siendo dicho efecto seleccionado del grupo que consiste en:

-la variación de la importación o exportación nuclear de factores de transcripción de la familia NF- kB;

-la alteración de la actividad de transcripción de factores de transcripción de la familia NF-kB; -la acetilación de histonas diferencial de p65 (RelA);

-la variación de la cantidad de complejos PPARγ/RelA en el citoplasma de las células; y

-destrucción nucleoplasmática de PPARγ.

Ensayo de fármacos candidatos para el cribado para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la modulación de las respuestas intestinales a la infección, en concreto a través del uso de la bacteria Bacteroides thetaiotaomicron.

Antecedentes de la invención

El intestino de los mamíferos es colonizado por varios cientos de especies bacterianas cuyas cantidades aumentan drásticamente en el colon, un sitio anatómico propenso a la infección, la enfermedad inflamatoria y el cáncer.

Sin embargo, la flora residente del tracto gastrointestinal de los animales adultos transmite un alto grado de protección (resistencia a la colonización) contra la infección (van der Waaij, 1984; Salminen et al., 1998) . Como resultado, la mayoría de los patógenos oportunistas que se encuentran en el entorno son incapaces de establecer un punto de anclaje y son excluidos rápidamente (van der Waaij, 1984; Salminen et al., 1998) . Sin embargo, si la flora comensal se ve comprometida, los patógenos oportunistas pueden entonces persistir en el intestino. Por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa no suele persistir en el intestino murino pero colonizará y causará una infección muy grave tras la alteración de la flora comensal con antibióticos (Pier et al., 1992) . Las bacterias comensales también confieren cierto grado de protección contra los patógenos virulentos, como Salmonella. Sin embargo, estos patógenos pueden desbordar o eludir los efectos protectores de la flora comensal y causar una infección grave si están presentes en cantidades significativas.

La resistencia a la colonización se debe, en parte, a la exclusión competitiva de las bacterias dañinas, a través del uso preferente de nutrientes y sustratos o del bloqueo de los sitios de anclaje potenciales en el intestino por la flora comensal. Sin embargo, las bacterias comensales también modulan los sistemas inmune y celular intestinal del hospedador (Br y et al, 1996; Herias et al., 1998; 1999; Hooper et al., 2000; 2001; Cebra, 1999; Snel et al., 1998; Talham et al., 1999; López-Boado et al., 2000; Shu et al., 2000; Campbell et al, 2001) . La flora puede modificar el tracto gastrointestinal para crear microambientes nicho adecuados para ellas pero no para otras bacterias.

De manera alternativa, pueden modificar las respuestas de las células epiteliales hacia las bacterias dañinas (Campbell et al, 2001) y atenuar así los cambios que facilitarían la colonización y la invasión.

El intestino sano mantiene un tono hiporreactivo hacia su diversa carga bacteriana, sin embargo la presencia de un nivel umbral de bacterias patógenas es suficiente para activar los sistemas transcripcionales que rápidamente sobrerregulan la expresión de genes proinflamatorios en los tejidos del intestino. A continuación, estos productos de transcripción desencadenan una cascada de respuestas que incluyen la quimiotaxis de las células polimorfonucleares (PMN) en la lámina propia de los sitios del intestino infectados. Aunque estos sucesos son esenciales para la eliminación de las bacterias, también causan patología en el tejido que puede agravar los síntomas de la enfermedad. El primer punto de contacto para las bacterias del lumen es una capa continua de células epiteliales que interactúan con y segregan el sistema inmunitario del intestino. La capacidad de las células epiteliales intestinales para discriminar entre bacterias patógenas y no patógenas es crucial para evitar respuestas inadecuadas perjudiciales para las bacterias colonizadoras y mantener la salud del intestino. Esta función discriminatoria está impresa en los sistemas de reconocimiento bacteriano y de señalización celular. El reconocimiento de las estructuras superficiales de la célula bacteriana es, en parte, una función de los receptores tipo Toll expresados en las superficies apical y basolateral de las células epiteliales, que desencadenan la activación inmunitaria mediada por el factor nuclear Kappa B (NF-kB) (Gerwirtz et al., 2001) .

Hasta ahora, no se han identificado los sistemas receptores vinculados a las actividades inmunosupresoras.

La administración de la bacteria comensal humana B. thetaiotaomicron a ratones libres de gérmenes desencadenó la expresión de genes clave ligados a la maduración intestinal y el desarrollo de la función de barrera (Hooper et al., 2001) . También aumentaron los niveles intestinales de Fucal, 2Galº-glicanos (Br y et al., 1996; Hooper et al., 2001) y la matrilisina (López-Boado et al., 2000) . También se descubrió que B. thetaiotaomicron modificaba las respuestas de las células epiteliales en la exposición in vitro a Salmonella (Campbell et al., 2001) . En concreto, hubo represión de algunas rutas proinflamatorias (Campbell et al., 2001) . A pesar de estas propiedades potencialmente protectoras,

B. thetaiotamicron no aumentó sin embargo la resistencia de los ratones libres de gérmenes ex a la infección por Clostridium perfringens serotipo A (Yurdusev et al., 1989) . No obstante, el agente patógeno se eliminaba del intestino si los ratones se trataban con B. thetaiotaomicron en combinación con Fusobacteria necrogenes (Yurdusev et al., 1989) y la cepa Clostridia no patógena CI (Yurdusev et al., 1986) . Esto sugiere que, aunque B. thetaiotaomicron sola puede inducir cambios potencialmente protectores en el intestino, puede necesitar actuar conjuntamente con otras cepas comensales para mejorar significativamente la resistencia global a la infección.

Los métodos terapéuticos se describen en la publicación de la patente internacional Nº 90/01335 que implica la sustitución de la microflora entérica anormal con una matriz de flora predeterminada en el sistema gastrointestinal del paciente a tratar. Se contempla una serie de especies de Bacteroides para la co-administración con otras especies como parte de la matriz anteriormente mencionada, una de las que puede ser opcionalmente Bacteroides thetaiotamicron. En la patente de los Estados Unidos Nº 5.951.977 se describen cultivos probióticos que comprenden prácticamente bacterias biológicamente puras, que pueden incluir opcionalmente Bacteroides thetaiotamicron.

La publicación de patente internacional Nº WO 01/16120, la publicación de patente internacional Nº WO 98/4308, y la publicación de patente internacional Nº WO 98/57631 muestran el uso de moduladores PPARa (derivados biaril-oxa (tia) zol, compuestos de fibrato y tiazolidinediona, respectivamente) en el tratamiento de una serie de trastornos y así sugieren su uso en el tratamiento de una serie de trastornos médicos. Los compuestos activos descritos en estos documentos no son microorganismos.

La publicación de patente internacional Nº WO 99/45955 se refiere a la ubicación inmunoestimulatoria de proteínas, que son antígenos para el autoanticuerpo pANCA y que puede ligarse al desarrollo de colitis ulcerosa. El antígeno pertinente se identifica como la histona H1. La solicitud internacional también identifica una proteína de 75kDa que tiene homología con la histona H1, se une a pANCA, y “por lo menos parte” de la que se expresa en

Bacteroides thetaiotamicron.

En esta invención definimos un mecanismo novedoso mediante el cual las bacterias no patógenas, normalmente la distribución nuclocitoplasmática de los PPARy y la actividad transcripcional de (NF-kB) .

Además, esta invención se refiere a la utilización de bacterias no patógenas para la modulación de las respuestas inflamatorias. Aún más, la invención proporciona evidencia para la acetilación diferencial de histonas de p65 (RelA) que afectan a la exportación mediada por IKBa de RelA y para un modo novedoso de acción para los receptores activados por el proliferador de peroxisomas (PPARy) . En concreto, la invención describe la atenuación de la expresión de genes inflamatorios epiteliales modificando la distribución nucleocitoplasmática de los PPARy y la actividad transcripcional de NF-kB mediante el uso de bacterias no patógenas. Además la presente invención proporciona un medio de atenuar la inflamación para el tratamiento y la prevención de enfermedades y trastornos inflamatorios.

La ruta novedosa descrita en la presente invención puede utilizarse para el cribado para métodos novedosos y para productos novedosos para modular la producción de citoquinas inflamatorias. Además, la presente invención describe el uso de una bacteria no patógena para atenuar la producción de citoquinas... [Seguir leyendo]

1. Un ensayo para seleccionar un medicamento candidato para el tratamiento de enfermedades inflamatorias debido a la producción de citocinas, dicho ensayo comprendiendo:

a) exponer dicho medicamento candidato a células intestinales; y b) analizar el efecto de dicho medicamento candidato, siendo dicho efecto seleccionado del grupo que consiste en:

- la variación de la importación o exportación nuclear de factores de transcripción de la familia NFkB; -la alteración de la actividad de transcripción de factores de transcripción de la familia NF-kB; -la acetilación de histonas diferencial de p65 (RelA) ; -la variación de la cantidad de complejos PPARy/RelA en el citoplasma de las células; y -destrucción nucleoplasmática de PPARy.

2. El ensayo de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de la selección de un medicamento candidato

que demuestra por lo menos un efecto seleccionado del grupo que consiste en: -el aumento de la exportación nuclear o la disminución de la importación nuclear de factores de transcripción de la familia NF-kB;

- la alteración de la actividad de transcripción de factores de transcripción de la familia NF-kB; -la acetilación de histonas diferencial de p65 (RelA) ; -el aumento de la cantidad de complejos PPARy/RelA en el citoplasma de las células; y -destrucción nucleoplasmática de PPARy.

3. El ensayo de la reivindicación 1 ó 2, en el que el efecto del medicamento candidato analizado es la exportación nuclear del factor de transcripción de la familia NF-kB.

4. El ensayo de la reivindicación 1 ó 2, en el que el efecto del medicamento candidato analizado es la variación de la cantidad de complejos PPARy/RelA en el citoplasma de las células.

5. El ensayo de la reivindicación 1 ó 2, que comprende además la etapa de analizar el efecto del medicamento candidato en el nivel de uno o más citocinas seleccionadas del grupo que consiste en TNF-a IL-8, MIP-2a y Cox-2.

6. El ensayo de la reivindicación 5, en el que el efecto del medicamento candidato analizado es la variación del nivel de IL-8 y/o MIP-2a.

7. El ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las células intestinales se obtienen de una línea celular mantenida en cultivo celular.

8. El ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha línea celular es una línea celular Caco-2.

9. El ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho ensayo se realiza in vivo en un animal.

10. El ensayo de la reivindicación 9, en el que dicho animal es un mamífero.

11. El ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el ensayo se lleva a cabo en presencia de bacterias patógenas conocidas.

12. El ensayo de la reivindicación 11, en el que dichas bacterias patógenas conocidas son Salmonela sp.

13. El uso de Bacteroides thetaiotaomicron para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria causada, por lo menos en parte, por una respuesta inflamatoria de células intestinales.

14. Una composición como la que se reivindica en la reivindicación 13, en la que la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria intestinal; enfermedad de Crohn; Síndrome del Intestino Irritable; artritis reumatoidea; síndrome de inmunodeficiencia; caquexia; esclerosis múltiple y proliferación de queratinocitos.

15. Una composición como la que se reivindica en la reivindicación 14, en la que la enfermedad inflamatoria es la enfermedad de Crohn.

16. Una composición como la que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en la que la composición se prepara para su administración a un paciente por medio de un producto alimentario o un supositorio.

17. Una composición como la que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en la que la composición se prepara para su administración oral.

18. Una composición como la que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en la que Bacteroides thetaiotaomicron está viva.

19. Una composición como la que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, que es capaz de alterar la actividad de transcripción de NF-kB.

20. Una composición como la que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, que es capaz de 10 aumentar la cantidad de complejos PPARy/RelA en el citoplasma de las células.

21. Una composición como la que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, en la que la composición es capaz de devolver el sistema inmune de un mamífero a la homeostasis y de mantenerla.

22. Una composición como la que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21, en la que Bacteroides thetaiotaomicron se selecciona según el ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

23. Una composición como la que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 22, en la que la enfermedad inflamatoria se asocia a la producción de una citocina inflamatoria.

24. Uso de Bacteroides thetaiotaomicron en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria causada, por lo menos en parte, por una respuesta inflamatoria de células intestinales.