DNA que codifica el alérgeno de mostaza amarilla (Sinapis alba) Sin a 3,

y sus aplicaciones.

La invención incluye el DNA que codifica el alergeno Sin a 3 de semillas de mostaza amarilla (Sinapis alba), reconocido por más del 30% de los pacientes alérgicos a esta fuente biológica. Asimismo, incluye dicho DNA recombinante clonado y expresado a partir de células hospedadoras eucariotas obteniéndose la proteína recombinante correctamente plegada y que mantiene propiedades inmunológicas equivalentes a las del alergeno natural. Por otro lado, la invención se refiere a un método de aislamiento y purificación del alergeno natural y a un método de purificación del alergeno recombinante.

Tanto la proteína Sin a 3 purificada como la proteína recombinante, las proteínas homólogas, las formas modificadas, derivadas de ellas, los fragmentos derivados que contengan al menos un epítopo alergénico, pueden ser empleadas en la elaboración de métodos de diagnóstico de alergias así como en la elaboración de sistemas de inmunoterapia.

DNA que codifica el alérgeno de mostaza amarilla (Sinapis alba) Sin a 3, y sus aplicaciones.

Sector de la técnica

La presente invención se encuadra en el sector de alergología, y especialmente de las alergias a pólenes de plantas. Más concretamente, se refiere a un DNA recombinante que codifica epítopos del alérgeno Sin a 3 de la mostaza amarilla (Sinapis alba), a la producción recombinante de los polipéptidos codificados por dicho DNA y al método de aislamiento del alérgeno recombinante. También se refiere a la aplicación de estas moléculas en sistemas de diagnóstico y en la elaboración de preparaciones para la terapia de esta afección inmunológica.

Estado de la técnica anterior a la invención

La alergia tipo I es una enfermedad que afecta a más del 20% de la población de los países industrializados (Kay, A.B. (1997) Allergy and allergic diseases, Blackwell Science, Oxford, UK). Esta afección es ocasionada por los alérgenos, presentes tanto en organismos y productos biológicos -alimentos, ácaros, venenos de insectos, pólenes, hongos, epitelios de mamíferos-, como en materiales de síntesis. En la mayor parte de las fuentes biológicas alergénicas, los alérgenos son proteínas de masas moleculares comprendidas entre 5 y 70 kDa. Los síntomas que se derivan de la alergia, tales como rinitis, conjuntivitis, o asma, son provocados por la liberación de mediadores celulares, como la histamina, desde basófilos y mastocitos, células del sistema inmune. Dicha liberación viene inducida por el entrecruzamiento de anticuerpos IgEs unidos a los receptores de alta afinidad Fc\BoxRI, los cuales se encuentran a su vez anclados a basófilos y mastocitos. El entrecruzamiento de las IgE es provocado por la unión del correspondiente alérgeno, o un fragmento suyo, a través de un epítopo IgE (contenido en dicho alérgeno, o en su fragmento). La terapia que actualmente se viene utilizando para tratar la alergia implica la hiposensibilización del paciente mediante la administración por vía parental u oral de dosis adecuadas del propio alérgeno, o alergoides relacionados. En la práctica totalidad de los casos se administra un extracto alergénico obtenido de la fuente biológica natural, lo que implica una mezcla muy compleja de proteínas y otras sustancias, en la cual, el alérgeno -o alérgenos- puede representar una parte ínfima del producto total utilizado.

La mostaza amarilla (Sinapis alba) es una especie incluida en la familia Brassicaceae a la que también pertenecen la mostaza oriental (Brassica juncea), la colza (Brassica napus), la col (Brassica oleracea), entre otras. La mostaza es una de las especias más alergénicas de las que se tiene constancia hasta la fecha, tanto por su prevalencia como por su potencia alergénica. Como para otros alimentos alergénicos, la sensibilización depende de los hábitos alimentarios de la población. Existen varios tipos de mostazas: amarilla, negra (Brassica nigra) y oriental, y se utilizan con distinta asiduidad usando incluso mezclas de las mismas en diferentes ámbitos geográficos. Los países que más consumen la mostaza son USA, Francia y Japón. La mostaza es un condimento frecuente en salsas variadas y diferentes aliños, curry, mayonesa, vinagreta, en el mismo kétchup, o como aromatizante, y a menudo está oculta en alimentos en los que, hasta hace relativamente poco tiempo, ni siquiera se daba razón de su presencia en el etiquetado. Esto se ha regularizado en la actualidad y la mostaza figura oficialmente en un informe de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) como uno de los alimentos cuya presencia ha de indicarse en la etiqueta de los envases. En general, su acceso al cuerpo humano es por ingestión, pero se han descrito casos de alergia a Brassicáceas por inhalación o contacto con la harina molturada o con piensos, sobre todo en personas cuyos puestos de trabajo estaban relacionados con la manipulación de estos alimentos (R.I. Monsalve, M.A. González de la Peña, López-Otín, C. Fiandor, C. Fernández, M. Villalba y R. Rodríguez. Clin. Exp. Allergy 27, 833-841 (1997)).

Los síntomas de los pacientes afectados por alergia a mostaza son típicos de las alergias alimentarias, tales como urticaria, eczema, asma bronquial, dolor gástrico, y puede llegar a ocasionar shock anafiláctico. La severidad de los síntomas ha llevado a algunos autores a desaconsejar el uso de los test de provocación oral para evitar la aparición de reacciones sistémicas indeseables (Monsalve, R.I., Villalba, M., Rico, M., Shewry, P.R., y Rodríguez, R. The 2S albumin proteins. En "Plant Food Allergens". Eds. C. Mills and P. R. Shewry. Blackwell Science Ltd. Cap. 3, pp 42-56, (2004)).

Entre los alérgenos caracterizados en mostaza y otras especies relacionadas destacan Sin a 1, que es el alérgeno principal de la mostaza amarilla, identificado desde hace más de 17 años, y su homólogo de Brassica juncea, Bra j 1. Sin a 1 fue la primera albúmina 2S para la que se demostró de manera precisa su alergenicidad. Pero las semillas de mostaza poseen más alérgenos relevantes. Otro importante alérgeno es la globulina 11S a la que se le ha asignado el nombre de Sin a 2. (R.I. Monsalve, M.A. González de la Peña, L. Menéndez-Arias, C. López-Otín, M. Villalba, and R. Rodríguez. Biochem. J. 293, 625-632 (1993); Monsalve, R.I., Villalba, M., y Rodríguez, R. Intern. Symp. Food Allergens 3, 57-69 (2001)).

En la actualidad, los protocolos utilizados para la diagnosis de casos de alergia y su posterior inmunoterapia implican el uso de extractos alergénicos que frecuentemente no están caracterizados, ni siquiera estandarizados respecto a los alérgenos más importantes que pueden contener. En el caso concreto de los alimentos, el uso de los extractos para el diagnóstico puede suponer riesgos adicionales ya que, debido a la severidad de los síntomas asociados a estas alergias, es, en estos casos, en los que aparecen algunas reacciones adversas durante el diagnóstico de estos pacientes, bien mediante pruebas cutáneas o en provocación oral. A menudo, su administración no proporciona un diagnóstico eficaz, sobre todo cuando la hipersensibilidad del paciente se refiere a alérgenos presentes en baja concentración en dichos extractos (Valenta, R.; Lidholm, J.; Niederberger, V.; Hayek, B.; Kraft, D. and Grondlund, H. (1999) Clin. Exp. Allergy 29, 896-904; Barber, D.; Moreno, C.; Ledesma, A.; Serrano, P.; Galán, A.; Villalba M.; Guerra, F.; Lombardero, M.; Rodríguez, R. (2007) J. Invest. Allergy Clin. Immunol. 17 (S1), 11-16). Por otro lado, la inmunoterapia realizada con estas preparaciones es frecuentemente ineficaz y origina en ocasiones efectos secundarios indeseables que pueden llegar a ser más graves que la propia afección alérgica que se pretende resolver. Una alternativa a la utilización de estos extractos es la preparación de mezclas de los alérgenos más significativos, obtenidos por aislamiento de su fuente natural (Rodríguez, R.; Villalba, M.; Monsalve, R.I. and Batanero, E. (2001) Int. Arch. Allergy Immunol. 125, 185-195). Sin embargo, esta vía presenta dos importantes barreras. Por un lado, implica un buen conocimiento de los componentes alergénicos del material que provoca la alergia, al menos de todos sus alérgenos principales, y este dato, frecuentemente, no está disponible. Por otro lado, el proceso de aislamiento de los alérgenos conocidos, a partir del material biológico, es a menudo difícil y no proporciona las cantidades necesarias o la calidad requerida para un posterior empleo, debido fundamentalmente a los bajos niveles en los cuales se encuentra. Todos estos problemas se acentúan cuando el material alergénico es el polen de una especie vegetal. La gran cantidad de pigmentos, carbohidratos, lípidos y componentes insolubles hacen muy difícil su manipulación. Ni qué decir tiene que su disponibilidad es, además, muy reducida y de alto coste económico, debido a la dificultad de su recolección. Por todo lo expuesto, se hace necesario el diseño de procedimientos para la producción de alérgenos a utilizar en los protocolos de diagnosis e inmunoterapia de la alergia.

Explicación de la invención

DNA que codifica el alérgeno de mostaza amarilla (Sinapis alba) Sin a 3, y sus aplicaciones.

Sin a 3, la molécula alergénica objeto de esta patente es un alérgeno de las semillas de la mostaza amarilla, al igual que los dos descritos anteriormente (Sin a 1 y Sin a 2), con una gran incidencia clínica potencial ya que, por estudios preliminares realizados por los inventores de esta patente, este alérgeno puede alcanzar una prevalencia superior... [Seguir leyendo]

1. Molécula polinucleotídica que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1.

2. Molécula polinucleotídica que comprende una secuencia que híbrida con SEQ ID NO: 1 en condiciones fuertemente restrictivas.

3. Molécula polinucleotídica que comprende una secuencia con, al menos, un 70% de identidad con SEQ ID NO:1.

4. Molécula según la reivindicación 3 en que la identidad con SEQ ID NO: 1 es de, al menos, el 80%.

5. Molécula polinucleotídica que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2.

6. Molécula polinucleotídica que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende un fragmento de SEQ ID NO: 2 con, al menos, un epítopo de Sin a 3 de Sinapis alba.

7. Molécula polinucleotídica que comprende una secuencia que codifica un polipéptido con las propiedades antigénicas y alergénicas de Sin a 3 de Sinapis alba.

8. Polipéptido aislado que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2.

9. Polipéptido aislado que comprende una secuencia con, al menos, un 70% de identidad con SEQ ID NO: 2 que conserva las características antigénicas de Sin a 3 de Sinapis alba.

10. Polipéptido según la reivindicación 9 en que la identidad con SEQ ID NO: 2 es de, al menos, el 80%.

11. Vector recombinante caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos definida según las reivindicaciones 1 a 7.

12. Vector recombinante según la reivindicación 11 que comprende el plásmido pPICZαA.

13. Células eucariotas hospedadoras transfectadas con los vectores recombinantes de las reivindicaciones 11 ó 12.

14. Células eucariotas según la reivindicación 13 que pertenecen a la especie Pichia pastoris.

15. Células eucariotas según la reivindicación 14 que pertenecen a la cepa KM71.

16. Uso de cualquiera de las moléculas polinucleotídicas de las reivindicaciones 1-7 en el diagnóstico de la alergia a Sin a 3 de Sinapis alba.

17. Uso de cualquiera de los polipéptidos de las reivindicaciones 8-10 en el diagnóstico de la alergia a Sin a 3 de Sinapis alba.

18. Uso según la reivindicación 17 en el que el diagnóstico se realiza "in vitro" mediante técnicas inmunológicas.

19. Uso según la reivindicación 18 en el que la técnica inmunológica es el ELISA.

20. Uso de cualquiera de los polipéptidos de las reivindicaciones 8-10 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la alergia a Sin a 3 de Sinapis alba.

21. Composición farmacéutica que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 8-10 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

22. Método para la purificación de cualquiera de los polipéptidos de las reivindicaciones 8-10 que comprende las siguientes etapas: