Detección de metilación genica para el diagnostico de un trastorno proliferativo.

Un procedimiento de diagnóstico de la presencia o predecir el curso de un trastorno proliferativo,

que comprendedeterminar el estado de metilación de un marcador para GSTP1 en una muestra biológica usando una sonda de ácidonucleico y cebadores oligonucleotídicos, en el que la sonda oligonucleotídica está codificada por la SEC ID Nº 25 y loscebadores oligonucleotídicos están codificados por las SEC ID Nº 23 y 24.

Detección de metilación génica para el diagnóstico de un trastorno proliferativo

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a la interrogación de genes metilados en ensayos diagnósticos y pronósticos para trastornos proliferativos celulares tales como el cáncer. Los genes implicados incluyen el gen de la glutatión-Stransferasa (GSTP1) o porciones del mismo.

En los eucariotas de orden superior el ADN está metilado únicamente en las citosinas ubicadas en 5’ con respecto a guanosina en el dinucleótido CpG. Esta modificación tiene importantes efectos reguladores sobre la expresión génica, especialmente cuando implica áreas ricas en CpG (islas de CpG) ubicadas en las regiones promotoras de muchos genes. La metilación aberrante de islas de CpG normalmente no metiladas se ha descrito como un suceso frecuente en células inmortalizadas y transformadas, y se ha asociado con la inactivación de la transcripción de ciertos genes supresores de tumores o genes de otro modo asociados con la mejora de ciertos cánceres humanos

La glutatión-S-transferasa (GST) cataliza las reacciones de destoxificación intracelulares, incluida la inactivación de carcinógenos electrofílicos, mediante conjugación de electrófilos químicamente reactivos al glutatión (C. B. Pickett, y col., Annu. Rev. Biochem., 58:743, 1989; B. Coles, y col., CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 25:47, 1990; T. H. Rushmore, y col., J. Biol. Chem. 268:11475, 1993) . Las GST humanas codificadas por varios genes diferentes a loci diferentes se han clasificado en cuatro familias denominadas alfa, mu, pi y teta (B. Mannervik, y col., Biochem. J., 282:305, 1992) . Muchos cánceres humanos, tales como los cánceres de próstata y hepáticos, exhiben disminución de la expresión de GSTP1 respecto a sus tejidos de origen.

Los documentos WO2004087957 y WO2004067777 divulgan procedimientos para predecir la evolución de un trastorno proliferativo en el que el estado de metilación del marcador GSTP1 se determina usando un reactivo que consiste en la secuencia gccccaatactaaatcacgacg. El documento WO2004113567 se refiere a procedimientos en los que parte de la GSTpI se amplifica para evaluar el estado de metilación.

En el caso del cáncer de próstata, en concreto, se ha demostrado que el diseño de cebadores y sondas para PCR específicos de metilación ("MSP") que discriminen entre la hiperplasia prostática benigna y el adenocarcinoma prostático es complejo. Los mejores conjuntos de cebador/sonda publicados normalmente muestran una sensibilidad de hasta aproximadamente un 75 % si se ajustan los ensayos a una especificidad del 100 % y una especificidad menor del 60 % si se ajustan los ensayos a una sensibilidad del 100 %. Se podría obtener un ensayo más sólido y consistente con nuevas combinaciones de cebador y sonda. La presente invención cumple dicha necesidad.

Sumario de la invención

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento de diagnóstico de la presencia o predecir el curso de un trastorno proliferativo, que comprende determinar el estado de metilación de un marcador para GSTP1 en una muestra biológica con el uso de una sonda de ácido nucleico y cebadores codificados por las SEC ID Nº 23-25.

En un aspecto de la divulgación, un procedimiento para detectar un trastorno de proliferación celular en tejido prostático u otra muestra de un sujeto implica poner en contacto un componente celular con un reactivo útil en la amplificación y detección de regiones hipermetiladas de ciertos genes.

En otro aspecto de la divulgación, al menos uno de estos genes hipermetilados es GSTP1 I, que se puede analizar en combinación con uno o más de otros genes.

En otro aspecto de la divulgación se obtiene una muestra de ácido nucleico que se sospecha que tiene secuencias diana metiladas de una muestra biológica, tratar la muestra co un reactivo que puede cebar una porción de la diana, amplificar el ácido nucleico diana y comparar el grado de metilación de la muestra amplificada con el de una muestra normal conocida. En otro aspecto más, una secuencia que no es probable que esté metilada se amplifica y detecta por comparación con la secuencia metilada amplificada.

En otro aspecto más, la invención proporciona un procedimiento para detectar un trastorno proliferativo celular. Esto se realiza amplificando un gen cuyo estado de metilación es indicativo del trastorno proliferativo celular. El procedimiento de detección puede incluir poner en contacto una muestra o fluido biológico que contiene ácido nucleico con un agente que modifica la citosina no metilada, amplificar el ácido nucleico en la muestra con cebadores oligonucleotídicos o cebar las secuencias que distinguen entre ácido nucleico modificado metilado y no metilado, y detectar el ácido nucleico metilado en base a la presencia o ausencia de productos de amplificación producidos durante la amplificación.

Los procedimientos de la invención abarcan determinar una proporción de metilación en una muestra. La proporción de metilación es la proporción entre el nivel de metilación de un Marcador (o una región de un Marcador) que está hipermetilado en un estado de enfermedad con respecto al nivel de metilación de un Marcador que no está hipermetilado en la misma condición (o respecto a una región del mismo Marcador que no está hipermetilada en la misma condición) . Cuando se determina la proporción de metilación mediante comparación de la metilación de un Marcador que está hipermetilado en un estado de enfermedad con otro marcador que no lo está, el segundo Marcador se puede denominar Marcador de referencia.

En otro aspecto de la divulgación, las proporciones de metilación se determinan mediante PCR cuantitativa en tiempo real.

En otro aspecto de la divulgación se proporcionan moléculas indicadoras para ensayos diagnósticos y/o pronósticos.

En otra realización, la divulgación proporciona un kit útil para realiza un ensayo de acuerdo con la reivindicación 1. El kit incluye uno o más contenedores; un primer contenedor que contiene un reactivo que modifica la citosina no metilada y un segundo contenedor que contiene un reactivo que ceba la amplificación de un ácido nucleico con contienen CpG, en el que el reactivo distingue entre ácido nucleico modificado metilado y no metilado.

En otro aspecto más, la secuencia de ácido nucleico que se detecta en los procedimientos de la invención o los kits para practicarlos incluye un promotor o una porción de un promotor.

En otro aspecto más de la invención, procedimientos y kits usados para detectar porciones metiladas de ciertos genes de acuerdo con las reivindicaciones también incluyen etapas y/o componentes para analizar la presencia de otro ácido nucleico. EL grado hasta el cual el gen metilado intencionadamente se ve afectado por el tratamiento (p. ej., amplificación) se compara con el de otro ácido nucleico para determinar la extensión de metilación del Marcador.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un gráfico de los resultados de ensayos MSPCR usando sondas y cebadores de la técnica anterior.

La Fig. 2 es un gráfico de los resultados de ensayos MSPCR usando sondas y cebadores de hidrólisis de acuerdo con la invención.

Descripción detallada de la invención

La hipermetilación de ciertos genes se correlaciona con la carcinogénesis prostática. Las secuencias de ácido nucleico que comprenden dichos genes o porciones de dichos genes se denominan Marcadores en esta memoria. Los Marcadores incluyen ácidos nucleicos que comprenden los genes siguientes o porciones de dichos genes: GSTP1 (SEC ID Nº 54) , RARB2 (SEC ID Nº 57) , RASSF1A (SEC ID Nº 64) , TIMP3 (SEC ID Nº 58) , APC (Promotor= SEC ID Nº 59, Gene= SEC ID Nº 60) , beta-Actina (SEC ID Nº 55 y 56) , PTGS2 (Promotor SEC ID Nº 61, Gen= SEC ID Nº 62) y 14-3-3 sigma (SEC ID Nº 63) .

Los ensayos para detectar dicha hipermetilación incluyen técnicas tales como MSP y análisis con endonucleasas de restricción. La región promotora es una diana particularmente importante para detectar dicho análisis de hipermetilación. El análisis de la secuencia de la región promotora de GSTP I muestra que casi el 72 % de los nucleótidos son CG y aproximadamente el 10 % son dinucleótidos de CpG.

La divulgación proporciona un procedimiento para determinar... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de diagnóstico de la presencia o predecir el curso de un trastorno proliferativo, que comprende determinar el estado de metilación de un marcador para GSTP1 en una muestra biológica usando una sonda de ácido nucleico y cebadores oligonucleotídicos, en el que la sonda oligonucleotídica está codificada por la SEC ID Nº 25 y los cebadores oligonucleotídicos están codificados por las SEC ID Nº 23 y 24.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende medir la presencia de un Marcador de referencia.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el Marcador de referencia está seleccionado del grupo que consiste en B Actina.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se usan uno o más Marcadores.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el uno o más Marcadores adicionales incluye un Marcador por APC, TIMP, RASSF1A, RARB2, PTGS2 o 14-3-3.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que los reactivos para el uno o más Marcadores adicionales incluyen un miembro del grupo que consiste en las SEC ID N.

2. 35 .

4. 53.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra es tejido prostático.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra es de orina, suero, plasma o células circulantes.

9. Una composición que comprende todos los miembros del grupo que consiste en SEC ID N.

2. 25.

10. Un kit para realizar un ensayo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende: amplificación de ácido nucleico y que comprenden todos los miembros del grupo que consiste en por las SEC ID N.

2. 25.

11. El Kit de acuerdo con la reivindicación 10, en el que los reactivos de amplificación y detección son las SEC ID º 2325 junto con los reactivos seleccionados del grupo que consiste en las SEC ID N.

3. 43.

12. El Kit de acuerdo con la reivindicación 10, en el que los reactivos detectan la hipermetilación de GSTP1.

13. El Kit de acuerdo con la reivindicación 10, que además comprende reactivos para amplificar y detectar la presencia de un gen expresado de forma constitutiva.

14. El Kit de acuerdo con la reivindicación 10, que además comprende reactivos para amplificar y detectar la presencia de genes expresados de forma constitutiva.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende establecer una proporción de metilación y determinar si la proporción de metilación supera un valor de corte.

16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en monitorización de terapia.

17. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en detección selectiva.

18. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en resolver resultados ambiguos o indeterminados de ensayos de cáncer obtenidos usando procedimientos diferentes a los de la reivindicación 1.